マメ科植物と窒素固定根粒菌との共生系を利用したファイトレメディエーション

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12875155
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 室岡 義勝 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (60029882)
• 研究分担者: 林 誠 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (30291933)
• キーワード: レンゲソウ / 根粒菌 / バクテロイド / メタロチオネイン / 重金属 / ファイトレメディエーション

研究概要

マメ科植物と根粒菌との共生関係を利用して、生物的窒素固定能に加えて重金属集積能等を付与した多機能共生系の優れたモデル系を構築する目的で下記の研究を行った。
1.緑肥植物、レンゲソウへの組み換え根粒菌の感染とその根粒形成:
グラム陰性菌で複製可能なpBBRおよびpRKベクターを用いて、先に研究代表者がレンゲソウ根粒より分離同定した根粒菌、Mesorhizobium huakuii subsp.rengei B3株を形質転換した。形質転換は先に開発したエレクトロポレーション法を用いた。このベクターに、重金属結合量を増加させたヒトメタロチオネイン4量体遺伝子を組み込み、バクテロイド中で発現するプロモーター等を検討して、レンゲソウの根粒菌内でメタロチオネイン遺伝子を高発現させた。
宿主側の緑肥植物、レンゲソウ(Astragallus sinicus cv.Japan)に上記メタロチオネイン遺伝子を導入した根粒菌を感染させ、試験管内で根毛内に根粒を形成させた。その後、根粒内のバクテロイドにおける遺伝子の発現を調べた。その結果、根粒バクテロイド内において、nifHおよびnolB遺伝子のプロモーター下のメタロチオネイン4量体遺伝子の発現が認められた。
2.レンゲソウへのメタロチオネイン遺伝子の導入:
上記根粒バクテロイド内での遺伝子発現とは別に、レンゲソウ植物体に直接遺伝子を導入することを試みた。植物発現用ベクターにメタロチオネイン遺伝子を組み込み、アグロバクテリウムの導入系を用いて、レンゲソウにマイクロインジェクション法およびバキュームインフィルトレーション法により形質転換を行った。両者とも高い効率で形質転換体が得られた。現在この系を利用して、メタロチオネイン4量体遺伝子の導入を行っている。

研究成果

• [文献書誌] S.-H.Hong: "Molecular design of novel metal-binding oligomeric human metallothioneins."Applied Microbiology and Biotechnology. 54. 84-89 (2000)
• [文献書誌] M.Hayashi: "Efficient transformation of Mesorhizobium huakuii subsp.rengei and Rhizobium species."Journal of Bioscience and Bioengineering. 89(6). 550-553 (2000)
• [文献書誌] K.Kasai: "Molecular cloning and characterization of two cDNAs encoding asparagine synthetase from Astragalus sinicus nodules."Journal of Bioscience and Bioengineering. 89(6). 559-563 (2000)
• [文献書誌] M.Hayashi: "Nodule organogenesis in Lotus japonicus"Journal of Plant Research. 113. 489-495 (2000)
• [文献書誌] Y.Naito: "The involvement of a cysteine proteinase in the nodule development in Chinese milk vetch infected with Mesorhizobium huakuii subsp.rengei"Plant Physiology. 124. 1087-1095 (2000)
• [文献書誌] S.-H.Hong: "High yield expression and single step purification of human thionein/metallothionein."Protein Expression and Purification. 21(1). 243-250 (2001)
• [文献書誌] H.Kobayashi: "DNA synthesis and degradation in bacteroids."Biosc.Biotech.Biochem. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] 鈴木孝仁 ら 編集: "微生物の資材化:研究の最前線"ソフトサイエンス社. 364 (2000)