|
膜結合型幼若ホルモン(JH)受容体を検索するため(1)哺乳類細胞、(2)アフリカツメガエル卵母細胞、を用いた発現クローニング系の構築を進めた。
(1)膜結合型JH受容体はある種のG-蛋白質共役型受容体であるとの作業仮説のもとに、カルシウムイメージングによりJH受容体遺伝子をクローニングするために哺乳類細胞HEK293TにG15、G16を導入した細胞株の樹立、およびトランジェントな発現系の構築を行った。現在、細胞株は樹立できていないが、トランジェントな発現系ではHEK293Tの内在性β-アドレナリン受容体をIsoproterenolおよびcarbamylcholineで刺激することでG15、G16を介して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることに成功した。今後この検定系を用いて膜結合型JH受容体の検索を行う予定である。
(2)電気生理学的手法を用いたアフリカツメガエル卵母細胞による発現クローニング系確立のため、まず、内在性カルシウムチャンネルを開くlysophosphatidic acidを外液に加えることで卵母細胞の膜電位の変化が変化することを確認した。さらに、カイコの各組織から調整したmRNAを卵母細胞に注入し、一定時間培養した後外液にJHを加えることで膜電位が変化するかどうかを測定したが、現在までポジティブな結果は得られていない。今後JHをJH結合蛋白質と同時に加えること、また、GIRKを同時に発現してカリウム電流を検出するなど検定系の改良を試みる予定である。
|
