|
本研究は、telomere seeding現象がテロメラーゼ活性に依存していることを確認するために、1.テロメラーゼ陰性である初代線維芽培養細胞にhTERT遺伝子を導入しテロメラーゼ活性を導入した場合、本現象がおきるか、2.テロメラーゼ活性陽性陽性HeLa細胞と、hTERTに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドでテロメラーゼ活性を抑制したHeLa細胞での比較、3.HeLa細胞をテロメラーゼ阻害剤で処理した群と未処理群との比較、をすることを目的としている。平成12年度は、各種ベクターとアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製を行った。
hTERT遺伝子導入ベクターの構築:hTERT遺伝子のfull length cDNAを、HeLa細胞由来m-RNAよりRT-PCRと5'-RACE法を用いてクローニングした。クローンをッシークエンシングにて確認後、発現ベクターpZeoSV(INVITROGEN)にサブクローニングした。
hTERT遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチド(AS-ODN)の作製:翻訳開始部位15-20merを中心にして5種類のAS-ODNを作製した(AS-ODN 1-5)。HeLa細胞を用いて、AS-ODN 1-5のうちで最も阻害するAS-ODN3を今後の検討に用いることとした。
Telomere seedingベクターの作製:テロメア配列をHeLa細胞のゲノムライブラリーよりクローニングし、pSP73(PROMEGA)に挿入する予定であったが、現在まで十分長いテロメア配列をクローニングできていない。現在も、検討中である。
|
