| 研究課題/領域番号 |
12877276
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
風間 淳 信州大学, 医学部・付属病院, 助手 (80273093)
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| 研究分担者 |
渋木 宏人 信州大学, 医学部・付属病院, 助手 (70313864)
春日 勇三 信州大学, 医学部, 助手 (10313850)
菊池 孝信 信州大学, 機器分析センター, 助教授 (50177797)
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| キーワード | 網膜光障害 / アポトーシス / caspase / TUNEL法 / 免疫組織化学 |
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| 研究概要 |
散瞳した8-10週齢の黒色マウス(C57BL/6)に白色蛍光灯を20000ルクス、2時間照射した。光照射後12,24,48時間のそれぞれでマウス眼球摘出・固定し、その網膜の光学顕微鏡観察用のパラフィン切片を作成した。
作成した標本において、TUNEL法(Gavrieli et al.J.C.B.1992)による染色を加え、アポトーシスを起こしている細胞を検出した。光照射12時間後から網膜視細胞層にTUNEL陽性細胞が見られ、そのピークは24時間後であった。48時間後には網膜内層にも陽性細胞が見られ、網膜光障害では網膜の外層から内層へとアポトーシスが進行することが示された。
同様に作成した標本においてアポトーシス関連遺伝子として知られるcaspaseファミリー(caspase 1、3、9)の発現を免疫組織化学的に検討した。抗caspase-1抗体陽性細胞は光照射12、24時間後の視細胞層に見られた。抗caspase-3抗体陽性細胞は光照射24、48時間後にそれぞれ視細胞層の約29.5%、22.5%に認められた。抗caspase-9抗体では光照射24時間後には視細胞のほぼ100%で陽性となった。
Western blotting法を行ったところ、caspase-1(ICE)のp20サブユニットのバンドが光照射12、24、48時間後に認められた。caspase-3のp20サブユニットに対するバンドは48時間後のみでみられた。
経時的に摘出した網膜からタンパクを抽出し、網膜光障害におけるcaspaseファミリーの酵素活性を合成ペプチド基質を用いて測定したところ、光照射24時間後に照射前の1.4倍に上昇していた。また、48時間後には1.1倍まで低下していた。
これらの結果から、光照射によってマウス網膜内のcaspase1活性が上昇することが示された。
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