遺伝子導入による瘢痕拘縮抑制の基礎的研究

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12877329
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 井口 次夫 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (40136685)
• 研究分担者: 池田 久住 長崎大学, 歯学部附属病院, 講師 (00244088)
• キーワード: 筋線維芽細胞 / FGFR2 / 遺伝子導入 / RT-PCR / ベクター / アポトーシス / Hsp47 / コラーゲン

研究概要

1.組み替え細胞の自己細胞死の原因究明-その二-
FGFR2遺伝子の強制導入による細胞死を遺伝子レベルにて調べた。検出対象としてミトコンドリア由来のbax遺伝子とp21遺伝子、およびp53をPCR法にて再検討した。用いた細胞はTGF-βで形質転換させた線維芽細胞と人為的に作成したRat創傷部から採取した筋線維芽細胞である。結果はTGF-β作用細胞には強いp53遺伝子の発現がみられた一方、採取細胞では弱い発現しか得られなかった。p21遺伝子もTGF-β作用細胞で発現が見られた。一方、双方の細胞共bax遺伝子の発現は見られなかった。これから、FGFR2遺伝子のアポトーシス機序は主に細胞核内の細胞死カスケードのSwitch onにより生じる可能性が示唆された。
2.コラーゲンゲル収縮実験
<自己細胞死の抑制によるゲル収縮の差異>
1の結果より筋線維芽細胞内のp53蛋白発現をブロックし、ゲル収縮の差にどれだけ影響するかを検討している。細胞は人為的に作成したRat創傷部から採取した筋線維芽細胞を用い、collagen latticeに細胞を播種した。最初にラット抗p53抗体を使用し筋線維芽細胞のアポトーシス抑制の有無を確認した。結果は思ったほど抑制効果は得られなかった。原因として抗体の細胞内への浸達が不十分である可能性が考えられた。次に現在Rat p53遺伝子のAnti-senseを作成しこれを細胞へ作用させている。結果の判定は免疫染色にて生細胞数を定量する予定である。
3.Hsp47発現抑制時のコラーゲン生成の評価
コラーゲンに特異的な分子シャペロンであるHsp47の発現抑制が、コラーゲン生成に及ぼす影響を検討した。ラットの創部由来線維芽細胞では、コラーゲンの著明な生成増加が認められた。antisenseを取り込ませることでHsp47発現を抑制すると、コラーゲン生成は正常レベルまで抑制された。更にin vivoで創部に直接antisenseをinjectさせると、治癒に伴う痕痕形成が軽減された。以上のことより、antisense against Hsp47が、癌痕形成の抑制に有用であることが示唆された。
4.Hsp47遺伝子発現のメカニズムの究明
新生児由来線維芽細胞ではTGF-β1を作用させると、Hsp47発現の増加が認められるが、胎児では認められない。この原因は少なくともpromoter活性の段階より上流であることが、reporter assayで明らかにできた。

研究成果

• [文献書誌] Wang Z.L., Inokuchi T., Ikeda H., Baba T.T., Uehara M., Kamasaki N., Sank K., Nemoto K.T., Taguchi T.: "Collagen-binding heat shock protein HSP47 expression during healing of fetal skin wounds"International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 31(2). 179-184 (2001)
• [文献書誌] Ohba S., Baba T.T., Nemoto K.T., Inokuchi T.: "Expression of Hsp47 in Fibroblasts Derived from Fetal and Neonatal Rat Tongues"Japanese Journal of Oral Biology. 44(6). 541-548 (2002)
• [文献書誌] Ohba S., Wang Z.L., Baba T.T., Nemoto K.T., Inokuchi T.: "Antisense Oligonucleotide against 47-kDa Heat Shock Protein (Hsp47) Inhibits Wound-Induced Enhancement of Collagen Production"Archives of Oral Biology. (In press).
• [文献書誌] Wang Z.L., Inokuchi T., Nemoto K.T., Uehara M., Baba T.T.: "Antisense oligonucleotide agaist collagen-specific molecular chaperone HSP47 suppresses scar formation in rat wound"Plastic & Reconstructive Surgery. (In press).