個体生命を支える素機構の統合

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12CE2007
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 近藤 寿人 大阪大学, 細胞生体工学センター, 教授 (70127083)
• 研究分担者: 杉野 明雄 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (90231737) ; 田中 亀代次 大阪大学, 細胞生体工学センター, 教授 (80144450) ; 濱田 博司 大阪大学, 細胞生体工学センター, 教授 (00208589) ; 米田 悦啓 大阪大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (80191667) ; 辻本 賀英 大阪大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (70132735)
• キーワード: 転写調節因子 / レチノイン酸 / DNA複製 / DNA損傷 / アポトーシス / インポーティン / ノックアウトマウス / 細胞分化

研究概要

1転写調節因子などのDNA結合蛋白質の潜在的な結合配列はゲノム上に多数存在するが、それらの中の特定のものが選択され、遺伝子の活性化などのゲノム上の反応が引き起こされる。その基本機構について、SOX因子による標的エンハンサーの特定機構を解析した結果、SOXがPOUファミリーやPAXファミリー因子などをパートナーとして協同的に作用し、クロマチン構造をもったゲノム上の標的配列に結合することを明らかにした。この因子間の協同作用が、細胞分化の特異性の機構である。細胞分化の多様性をもたらすのが、比較的単純な原理と転写制御因子の組み合わせによることを明らかにし、定式化できた。
2レチノイン酸分解酵素についての研究が進展した。細胞分化にはレチノイン酸の作用が広く関わるが、レチノイン酸の作用は、その核内受容体のレベルよりも、レチノイン酸の合成、分解によって大きく制御されていることを示した。CYP26A1の欠損マウスの解析から、一部の器官におけるレチノイン酸の役割が示唆されたが、もう一つの分解酵素が同定され、CYP26A1の欠損で異常が見られなかった器官での役割が予想されている。
3真核生物染色体DNA複製開始を実現する各ステップが、明らかになってきた。ゲノムDNAの複製開始点にMcm、Orcなどの蛋白質が同様の機構で結合した後、Cdc7キナーゼなどによる開始点の活性化がおこり、そこに更にα、δ、εの3種のDNAポリメラーゼがロードされて、DNA複製が開始されること、Cdc7キナーゼの作用が、DNA複製を細胞周期あたり1度に限定していることが明らかになった。Orc蛋白複合体を中心としたPre-RC形成、プロテインナーゼによるPreRCの活性化、複製開始部位の二本鎖DNAの解裂、DNAポリメラーゼα、δ、εのローデイングの分子機構のの研究が進行した。今後、酵母や哺乳類細胞を用いたin vitro複製系の開発、マウスやヒト細胞の染色体複製開始部位の単離が必要である。
4複製されたDNAが損傷を受けると、特に転写中の遺伝子を優先してDNA修復反応が起きる。XPA経路のDNA修復にかかわるXAB2蛋白質は6-20種類の新規蛋白質と複合体を構成するが、その複合体の機能として、転写伸長活性をもつことを始めて明らかにした。XAB2複合体はこれまで知られていない蛋白質複合体であり、新しい生命現象の解明に結びつく可能性がある。XAB2欠損マウスは胎児期に致死となる。XAB2の条件的ノックアウトをもちいて、XAB2の転写と共役したDNA修復機能に関する研究をすすめる。XPA経路とも関係するCSA/CSB蛋白質についての研究が進展した。DNA損傷により、CSB蛋白質依存性に、CSA蛋白質が核全領域から核マトリクスに移行することを見つけた。CSA蛋白質が核となる蛋白質複合体の解析をすすめる。
5細胞の生死決定機構を構成するBcl-2ファミリー蛋白質の機能の詳細な解析がすすんだ。とりわけ、DNA傷害により誘導されるアポトーシスシグナルの同定に成功し、DNA傷害修復の解析を行っているメンバーとの共同研究が実施された。DNA修復の欠損や様々なストレスによって、同一細胞内のミトコンドリア膜の透過性を、VDACの開孔によって亢進させ、Bcl-2などの抑制因子との相互作用をへて、また、インポーティンの機能依存的に核にアポトーシスシグナルを送ることが明らかになった。アポトーシスを制御する核蛋白質Acinusの欠損マウスは初期胚致死であった。条件的ノックアウトマウスの作成により、Acinusの生体での機能の解明を目指す。
6β-カテニンやインポーティンβといった、核膜孔を両方向性に移行することのできる分子に着目して、蛋白質の核膜孔通過のステップの分子機構を明らかにする研究をおこなった。インポーティンβの種々の変異体を作成して活性を解析した。mRNAの核外輸送機構を解明するために、mRNAの輸送担体と考えられるTAP/p15複合体の解析を行った。p15がTAPに結合することにより、TAPと核膜孔複合体構成要素ヌクレオポリンとの親和性が調節されてmRNAを結合したTAPが核膜孔を通過できるようになる。脳神経系での発現が顕著なインポーティンα(NPI-1)のノックアウトマウスを作成した。今後、関連蛋白質遺伝子のノックアウトマウスを作成する準備をすすめている。

研究成果

• [文献書誌] Nishizaki, Y. et al.: "Identification of essential sequence motifs in the node/notochord enhancer of Foxa2(Hnf3b) gene that are conserved across vertebrate species"Mech. Dev.. 102. 57-66 (2001)
• [文献書誌] Kamachi, Y. et al.: "Pax6 and SOX2 form a co-DNA-binding partner complex that regulates initiation of lens development"Genes Dev.. 15. 1272-1286 (2001)
• [文献書誌] Sakai, Y. et al.: "CYP26/P45ORA, a retinoic acid-inactivating enzyme, is required for establishing an uneven distribution of retinoic acid alongthe anteroposterior axis within the mouse embyro"Genes & Dev.. 15. 213-225 (2001)
• [文献書誌] Yamamoto, M.et al.: "A transcription factor FoxH1/FAST mediates Nodal signaling during anterio-posterior patterning and node formation in the mouse"Genes & Dev.. 12. 1242-1256 (2001)
• [文献書誌] Murai, M. et al.: "Early postnatal ataxia and abnormal cerebellar development in mice lacking xeroderma pigmentosum group A and the Cockayne syndrome group B DNA repair genes"Proc. Nati. Acad. Sd., USA.. 98. 13379-13384 (2001)
• [文献書誌] Kamiuti, S.et al.: "Translocation of Cockayne syndrome group A protein to the nuclear matrix: possible relevance to transcription-coupled DNA repair"Proc. Natl. Acad. Sci., USA,. (in press).
• [文献書誌] Waga, S. et al.: "DNA Polymerase epsilon is required for co-ordinated, rapid and efficient chromosomal DNA replication in Xenopus egg extracts"Proc. Natl. Acad. Sci., USA,. 98. 4978-4983 (2001)
• [文献書誌] Kamimura, Y. et al.: "Sld3, which interacts with Cdc45 (SId4), functions for chromosomal DNA replication in Saccharomyces cerevisiae"EMBO J.. 20. 2097-2107 (2001)
• [文献書誌] Hata, S. et al.: "Vascular smooth muscle maintains the levels of Bcl-2 in endothelial cells"Atherosclerosis. 152. 309-316 (2001)
• [文献書誌] Shimizu, S. et al.: "Essential role of voltage-dependent anion channel in various forms of apoptosis in mammalian cells"J.Cell Biol.. 152. 237-250 (2001)
• [文献書誌] Nagoshi, E. et al.: "Dimerization of the sterol regulatory element-binding protein-2 via the helix-loop-helix-leucine zipper domain is prerequisite for its nuclear localization mediated by importin b"Mol. Cell. Biol.. 21. 2779-2789 (2001)
• [文献書誌] Shimizu, S.et al.: "Essential role of voltage-dependent anion channel in various forms of apoptosis in mammalian cells"J.Cell Biol.. 152. 237-250 (2001)
• [文献書誌] Kurisaki, A. et al.: "Transforming growth factor-b induces nuclear import of Smad3 in an importin-b1 and Ran-dependent manner"Mol. Biol. Cell.. 12. 1079-1091 (2001)
• [文献書誌] Hieda, M. et al.: "Nuclear import of the U1 A splicesome protein is mediated by importin a/b and Ran in living mammalian cells"J.Biol. Biol.. 276. 16824-16832 (2001)