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自然界の微生物は、ほとんどが培養困難で通常複雑な群集をなしており、自然界の莫大であるが未利用の微生物資源を利活用することが将来大変重要になっている。最近では微生物群集を丸ごと解析するメタゲノム解析が盛んであるが、メタゲノム解析だけではどの微生物種がどの機能を有しているかなどの基本的な理解には至っていない。本課題では、セルロース資源の有効利用に働くシロアリの共生原生生物を題材とし、個々の種の機能の解明とそれら難培養微生物の遺伝資源を利活用できるようにすることを目的とし、培養を介さないで、原生生物の1細胞を単離して解析する方法を開発して適用することを実施した。
共生原生生物の遺伝情報を調べるにあたって、1細胞をハイスループットに単離することが有効と考え、フローサイトメータ装置を用いて、チューブリン抗体を用いて蛍光染色後に原生生物特異的に1細胞ずつを分取することができるようになった。条件検討後、蛍光染色しつつ固定した細胞から全ゲノムを増幅できるように最適化を行った。これにより全ゲノムを増幅した後にPCR法で目的遺伝子を解析することできるようになった。しかし、原生生物細胞に共生する細菌のゲノムDNAも同時に増幅されてしまうことが問題となることが判明した。
原生生物の遺伝子のみを解析するために、生細胞1細胞を分取してcDNAを合成して解析することを試みた。ヤマトシロアリ(Reticulitermes speratus)の記載されている18種の原生生物について、文献情報を精査して、細胞形態で見分ける特徴を明確にした。顕微鏡下で細胞形態を確認しながらマイクロマニピュレータ装置を用いて特定種の1細胞を単離してcDNAを合成した。全18種の原生生物について、分取することができ、条件検討の結果、合成したcDNAからアクチン遺伝子をPCR増幅することに成功した。
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