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本研究では、Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）患者由来iPS細胞において、TALENやCRISPRなどの人工ヌクレアーゼを用いたジストロフィン遺伝子をゲノム上で修復することで、機能性ジストロフィンを回復させることを目的としている。これまでに私は、DMD-iPS細胞において機能性ジストロフィンを回復させるために、以下のような実験を検討してきた。
１. TALENs発現ベクターの構築と細胞導入。ジストロフィン遺伝子のエクソン45の開始点部分に、いくつかのTALENとCRISPRのガイドRNAをデザインし、それらの発現ベクターを構築した。TALENやCRISPRの切断によるルシフェラーゼ活性の回復を利用したSSAアッセイを用いて、 TALENとCRISPRの切断活性を確認した。また、DMD-iPS細胞にエレクトロポレーション法であるNEPA21を用い、導入効率の条件検討を行った。
２. TALENsのゲノム上ターゲットサイトへの変異導入効率解析。TALEN切断部位に存在する制限酵素による切断解析を行い、約15-25%の変異導入効率を得ることができた。さらに変異導入傾向を確認するため、次世代シーケンス解析を行い、さまざまな長さの欠損および挿入が確認された。
３. ジストロフィン修復した細胞のクローン化と骨格筋細胞への分化 。TALENによるジストロフィンタンパク質のフレームが回復しているクローンとTALENやCRISPRを鋳型と共導入でエクソン４４ノックインしたクローンの樹立に成功した。これらのクローンをDox誘導型MyoD発現の分化方法を用いて、骨格筋細胞に分化させ、最終的にジストロフィンmRNA及びタンパク質の発現が確認できた。
これまでの結果を踏まえて、TALENやCRISPRのゲノム編集技術を用いて、エクソン45スキッピング、フレームシフトの誘導、またはエクソン44の挿入の三つのアプローチによるジストロフィン遺伝子異常の回復が可能であることを示した。
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