| 研究課題/領域番号 |
12J03099
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
尾木野 弘実 九州大学, 大学院農学研究院, 特別研究員(DC1)
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| キーワード | アーキア / DNA複製 / レプリソーム / DNAへリカーゼ / タンパク質間相互作用 |
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| 研究概要 |
好熱性アーキアThermoplasma acidophilumにおいてDNA複製に深く関わることが予想される、MCMヘリカーゼ、GiNS、複製起点認識タンパク質の一つであるCdc6-2、近年注目されているGAN (GINS-associated nuclease、バクテリアのRecJホモログ)について、主にリコンビナントタンパク質を用いて詳細に機能解析を行った。
T. acidophilztm由来のGINSはGins51タンパク質のホモ4量体であり、酵素活性を示さない。Gins51はアーキア、真核生物に広く保存されたA及びBドメイン、その間の保存性の低いリンカー領域を持つ。ゲル濾過クロマトグラフィーの結果、GINS4量体の形成にはBドメインは必要なく、Aドメインとリンカー領域があれば十分であることが分かった。さらに、このBドメインを欠損したGINSは野生型と同じ効率でMCMと相互作用し、ヘリカーゼ活性を促進した。一方で、Aドメインだけでは2量体を形成し、MCMの活性にも影響を与えなかった。共同研究により、Thermococcus kodakarensis由来Gins51タンパク質のBドメインがGANと相互作用することも示唆されており、Ginsタンパク質にはドメインごとの明確な役割分担がある可能性がある。これらのGINSと他のタンパク質との相互作用メカニズムはアーキア、真核生物に共通している可能性があり、今後様々な生物種での研究の進展が期待される。
GANはMn依存的なヌクレアーゼ活性を持っており、さらにその活性はGINSによって促進されることが明らかになった。さらに、現在GAN-GINS複合体がMCMの機能に与える影響を解析している。
前年度の研究結果に引き続いて、MCM、Cdc6-2、GINSからなる複合体がT. acidophiium細胞内でも生じているかを免疫沈降法により調べた結果、MCM、Cdc6-2、GINSは細胞内においても同じ複合体内に存在していた。現在、これら3つのリコンビナントタンパク質とDNAを混合後、グルタルアルデヒドによる架橋反応を行って得られる高次複合体の単離を行っている。複合体の単離後、電子顕微鏡観察による構造解析を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度までに得られた結果を査読付き学術雑誌に投稿準備中である。機能解析に用いるタンパク質の変異体は一部を除いてほとんどが順調に調製できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、他グループとの共同研究によりT. acidophilum由来GANホモログ2種類およびGINSが相互作用する因子の探索を酵母ツーハイブリッド法により行っている。この結果をふまえて、GAN、GINS、新規因子がDNA複製において果たす役割を解析する。特にGANについては、既知のDNA複製関連タンパク質との相互作用の有無を調べるとともに、MCMのDNA結合、ATP加水分解、ヘリカーゼ活性に与える影響を明らかにする。
MCM、Cdc6-2、GINS、GANを含む複合体を単離し、電子顕微鏡観察及び3次元再構築を行う。GINS、GAN複合体のX線結晶構造解析も並行して行う。
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