| 研究課題/領域番号 |
12J05431
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
村山 恵司 名古屋大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| キーワード | 人工核酸 / 蛍光性核酸検出プローブ / Molecular Beacon / RNAモニタリング / 細胞内イメージング / SNA |
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| 研究概要 |
核酸検出法は生物学分野・医学分野において欠かすことのできない技術である。現在、核酸検出プローブとしてDNAと蛍光色素・消光剤で構成されたモレキュラービーコン(MB)が一般的に用いられているが、細胞内での使用においては分解によるシグナル発生が問題となる。そこで酵素耐性をもつ、人工核酸SNAのみで構成されるMBの開発を行った。まず、SNAへの色素の導入位置を検討した結果、SNAの末端に、蛍光色素1分子に対し消光剤2分子を対に導入することで極めて高効率な消光がおこることを見いだした。このような性質はDNAには見られない、SNA特有のものであり、蛍光性プローブの機能に有利な性質といえる。次にこの設計を活かしSNAのみで構成されるMB(SNA-MB)を合成し、RNAの検出を試みた。その結果、Target RNA非存在下の蛍光強度は0.40であったのに対し、Target存在下では604となり、S/B比(シグナルバックグラウンド比)は約1500倍となった。同様の設計のDNAのMBではS/B比が33倍程度であったことから、このSNA-MBは従来のDNAで構成されるMBに比べ極めて高い検出感度を持つことが示された。次に酵素耐性の評価を行った結果、DNAのMBの場合、約6時間で半分程度が細胞内酵素によって分解されてしまったのに対し、SNA-MBは12時間経過してもほとんど分解が確認されなかった。以上のように、極めて高い検出感度と酵素耐性を持つSNAのMBを開発することに成功した。このSNA-MBを用いれば、細胞内におけるリアルタイムでのmRNA検出・イメージングが実現でき、疾病原因遺伝子の発現機構の解明・治療法の開発に大きく寄与できる。また、これまでに報告されている蛍光性核酸プローブに比べ、はるかに高い検出感度を持つことから、これまで極めて困難だった遺伝子の点変異の蛍光検出など様々な応用が十二分に期待出来る。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の目的であった、SNAのみで構成されるMBの合成・検出能の確認・酵素耐性の評価だけでなく、このSNA-MBの超高感度化に成功し、従来の核酸検出プローブを超える性能を達成できたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
SNA-MBを用いて細胞内のRNA検出を行う。まず、細胞内に特定のRNAをコードするプラスミドをトランスフェクションし、Target RNAを強制発現させた系を作製する。その細胞にSNA-MBを導入し、RNAの有無で蛍光が変化することを確認する。その後、細胞内在性のRNAを検出・リアルタイムモニタリングすることを目指す。
また、SNA-MBの高感度を活かし、核酸の定量や遺伝子の点変異の蛍光検出への応用を目指す。
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