| 研究課題/領域番号 |
12J07370
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
松本 早紀子 名古屋大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| キーワード | 神経再生 / メタロプロテアーゼ / 運動ニューロン / 軸索ブランチング / 発生 / yeast two hybrid |
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| 研究概要 |
Damage-induced neuronal endopeptidase(DINE)のプロテアーゼ活性と軸索ブランチングとの関連性の評価
DINEは、中枢・末梢を問わず損傷神経細胞で発現誘導される膜一回貫通型メタロプロテアーゼである。
DINE KOマウスは横隔神経の軸索ブランチング形成異常を起こし生直後死に至るが、この生理現象とDINEのプロテアーゼ活性との関連性を調べるために、DINE KOマウスのレスキュー実験を行う必要があった。そのため、この実験のツールとして必要不可欠なDINEのトランスジェニック(Tg)動物作製に取りかかった。DINEの野生型およびプロテアーゼ活性部位変異型をそれぞれ発現させる二種類のコンストラクトを作製し、BACシステムを用いてTgマウス作製を何度か試みたが全く得られなかった。そのため、BACシステムではなく従来のTg動物作製手法でも試みたところそれぞれ10ライン程度獲得できたので、現在DINEの発現と組織特異性を確認している。
DINE結合タンパクの探索
レスキュー実験と並行して、DINEの結合タンパクの探索にも取りかかった。DINEの基質はいまだ不明であるため、DINEが機能するために必要な足場タンパクや結合タンパクの同定は今後の基質探索や機能解明に重要な足がかりとなることが期待された。dual membraneシステムを用いたyeast two hybridを行った。酵母でDINEを発現させるコンストラクトを作製し、予備実験によって適切なスクリーニング条件を決定した。マウスadult脳cDNAライブラリーを用いたスクリーニングを行い、二次スクリーニングと配列決定により50個程度のクローンを得た。現在これらの分子についてin situ hybridizationによりDINEとの共局在を確かめているところで、今後免疫沈降によって実際の結合を評価する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
DINE Tgマウス作製において、当初の計画であったBACシステムの利用ではTg動物が得られず、従来通りの手法を用いて現在動物を獲得しつつある。Tg動物の獲得に少々難航したため、当該年度に実施予定であったTg動物のキャラクタライゼーションまで進められなかった。またDINEの結合タンパク探索でもシステムが上手く働くまでに時間を要したため、タンパクの同定までこぎつけることができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
野生型/変異型DINE Tgマウスのトランスジーンの発現および組織特異性を確認後、それぞれのTgマウスのキャラクタライゼーションを行う。また、KOマウスとの交配によりKOマウスの横隔神経ブランチング異常が野生型/変異型でそれぞれレスキューされるかを評価し、正常な運動神経ブランチングに対するDINEのプロテアーゼ活性の重要性を確認していく。変異型との交配でもKOマウス表現型がレスキューされた場合はDINEがプロテアーゼとは異なる機能を持つ可能性を考えていく。DINE結合タンパクの探索では免疫沈降などによって結合タンパクを同定し、生体内でDINEと結合することの意味および機能の解明に取り組む。
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