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1. Damage-induced neuronal endopeptidase (DINE)のプロテアーゼ活性評価
DINEは胎生期運動ニューロンに豊富に発現する膜一回貫通型のメタロプロテアーゼである。DINE欠損マウス(KO)では、横隔神経の軸索分枝異常により神経筋接合部が形成されず生直後死に至る。DINEの基質は同定されておらず、プロテアーゼとして機能するという証拠は未だ得られていない。そこで本研究ではDINE過剰発現マウス(Tg)を用いたDINE KOのレスキュー実験を行った。胎生期運動ニューロン特異的に野生型DINEまたはプロテアーゼ活性部位を欠失させた変異型DINEを発現するDINE Tgを作製し、KOとの交配を行った。その結果、野生型DINE TgはKOの胎生期運動ニューロン軸索分枝異常をレスキューし、生後生存することができた。一方、変異型DINE Tgとの交配では、KOの表現型がレスキューされず、生直後死亡した。以上のことから、DINEが胎生期運動ニューロンでプロテアーゼとして機能していることが明らかになった。
2. シュワン細胞を介したDINEの機能メカニズム
DINEの機能メカニズムを検討するために、DINE KOの横隔神経を形態学的に詳細に観察したところ、シュワン細胞の形態に異常が認められた。このことから、軸索に存在するDINEが運動ニューロン-シュワン細胞間相互作用を制御している可能性が考えられた。そこで、胎生期におけるシュワン細胞の分化マーカーの発現を比較したところ、KOで一部の分化マーカーの発現が有意に減少していた。また、運動ニューロンとシュワン細胞の共培養を行うと、軸索に沿って並ぶシュワン細胞の数の割合がKOで有意に減少していた。以上の結果から、DINEによって切断された基質が軸索－シュワン細胞間相互作用を制御し、適切な軸索分枝が形成される可能性が示唆された。
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