| 研究課題/領域番号 |
12J07554
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
湊 菜未 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| キーワード | 植物ウイルス / 原形質流動 |
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| 研究概要 |
本研究では、これまで全く未知であったウイルスの細胞内移行が植物の原形質流動を利用したものであると考え、原形質流動に着目してウイルスの移行メカニズムを解明する。植物ウイルスの感染は、ウイルスの「複製」、「細胞間移行」、「長距離移行」という3段階を経て進行する。初期感染細胞においてウイルスは、まず宿主細胞内の膜構造を変形させた「複製複合体」という構造体を形成し、その中で複製を行う。多くの植物ウイルスの複製複合体は小胞体(ER)膜上に形成され、その中には複製に必須なウイルスの複製酵素(RdRp)が含まれる。さらに、植物ウイルスは複製後、隣接細胞との間をつなぐ原形質連絡(plasmodesmata ; PD)を経由して、隣の細胞へと移行していく。ウイルスがER膜上で複製したのちPDに至るまでには、ウイルスは細胞内を移行すると考えられている。しかし、ウイルスが複製を行った後、どのように複製の場であるERからPDへと移動し、PDから隣接細胞へと移行を行っているかについては知見が乏しいままだった。一昨年植物細胞の原形質流動に関して、ERが他のオルガネラを巻き込みながら、ミオシンを介してアクチン上を流動することによって原形質流動が起こるとする新規なモデルが提唱された。そこで申請者は、この原形質流動に関するモデルに着目し、ウイルスの複製複合体は、植物細胞内においてER膜上に存在したまま原形質流動を利用して移動し、さらにその形状を保って細胞間移行するものと考えた。
前述した目的を達成するために、本年度においては「原形質流動とウイルスの細胞内移行をトレースする」ことを目標とし、以下の研究を実施した。
(1)RdRp抗体の作出
次年度以降に実施予定であるウイルス複製複合体の挙動解析のために、Radish mosaic virus(RaMV)の複製酵素(RNA-dependent RNA polymerase ; RdRp)に対する特異的な抗体を作出した。
(2)形質転換体の作出
原形質流動を可視化するため、緑色蛍光タンパク質(GFP)により小胞体(ER)、および赤色蛍光マーカーtdTomato-ABD2によりアクチンを標識した形質転換シロイヌナズナを作出中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画の通り、今年度は特別研究奨励費を用いてウイルスの複製複合体の根幹をなす複製酵素(RdRp)に作用する抗体を作出し、複製複合体のトレースおよび複製複合体に含まれる宿主因子の同定に向けた研究の基盤作りを行った。
また、計画の範疇でなかった透過型電子顕微鏡の操作についても積極的に他の機関に出向いて習得を試みた。これにより、透過型電子顕微鏡を用いた複製複合体の実体を捉える研究も可能になると考えられ、本研究の遂行に向けてさらなるアドバンテージを得られたと確信している。
来年度以降、当初の研究計画通りに遺漏なく解析を遂行する予定である。遂行予定の実験は以下の通り。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)ウイルス複製複合体の挙動解析
上記の形質転換体に青色に蛍光標識したウイルスゲノムRNAを発現させ、ERのアクチンに沿った移動により可視化される原形質流動の軌跡とウイルス複製複合体の移行経路を、蛍光顕微鏡を用いたリアルタイムイメージングで比較する。
(2)原形質流動非存在下でのウイルスの挙動解析
原形質流動の無い状態でのウイルスの動きを観察し、細胞内移行が原形質流動に依存しているかを検証する。原形質流動の起こらないカルシウムイオンおよびカルモジュリン過剰条件下において、リアルタイムイメージングで観察を行う。
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