| 研究実績の概要 |
本研究は複数のインテグレースシステムを用いて、性質の変化した細胞の系譜を多色の発光遺伝子と蛍光遺伝子のパターンを変化させることで詳細に追跡する新規レポーターシステムを構築する事を目的として研究を行った。システムは、ルシフェラーゼ遺伝子をインテグレースのターゲットサイトで挟み、インテグレースの発現によってルシフェラーゼ遺伝子が除去され、蛍光遺伝子が発現するデザインとした。このシステムはそれぞれTP901-1, R4, Bxb1のインテグレース毎にGFP, OFP, RFPが発現する３種類のベクターを作成し、それぞれのシステムからの転写干渉を防ぐためインスレーターを挟みタンデムに繋げた。このベクターとインテグレースをCHO細胞にコトランスフェクションを行った結果、インテグレース発現に応じた蛍光タンパク質の発現が確認された。
構築されたベクターは30kbを超え、安定発現する細胞株を取得する事が困難であった事と、コピー数とポジションエフェクトを回避しながら細胞内に維持するためにマウス人工染色体ベクターへと搭載を行った。マウス人工染色体を保持するCHO細胞にレポーターシステムとCre recombinaseを発現させるためのベクターをコトランスフェクションし、人工染色体上にあるloxPサイトに組み込み、さらに人工染色体上でプラスミド同様にレポーターが作動することを確認した。この結果は人工染色体上に搭載した任意の遺伝子の発現を特異的なインテグレースの誘導により変換可能な事を示唆した。
人工染色体に搭載した本システムはマウスのin vivoイメージングに用いる為CHO細胞からマウスES細胞へ微小核融合法により導入を試みているが、適切なクローンが取得されていない為、条件の最適化を行っている。
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