| 研究課題/領域番号 |
12J09656
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
大和屋 健二 千葉大学, 大学院・医学研究院, 特別研究員(PD)
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| キーワード | 受精 / 先体 / エンドサイトーシス / 精子 / 糖タンパク質 |
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| 研究概要 |
本年度に計画していたequatorinと免疫共沈降する分子の質量解析による同定と、その結果得られた分子の細胞発現用ベクターの作成、さらにはEQT-EGFPマウスにおける遺伝子座を決定し高輝度EQT-EGFPマウスを作製することができ、1年目の計画はすべて達成できた。その結果、2年目に計画していたEQT-EGFPマウスを用いた受精におけるエンドサイトーシス過程のライブイメージングに取りかかることが出来た。
その結果、より効率的に受精過程を撮影する条件検討の過程で、先体反応に関する新たな知見が得られ、現在、論文執筆中である。また、GALNT3 Knock outマウスの解析によって得られた知見は、equatorinの糖鎖修飾はMN9抗体認識部位の立体構造形成に重要であることを、精子を用いて初めて示唆する結果となった。
以上の成果より、equatorinは先体および先体周囲のマトリクスと相互作用しており、より精密な分子間相互作用の解析が必要であることが明らかとなった。この中には、アミノ酸配列のみでなく糖鎖修飾も含まれる。さらに、今回行った先体反応の解析の結果、equatorinタンパク質に対して酵素活性を示す分子を発見することができた。
このことは、真獣類で広くアミノ酸配列が保存されている1回膜貫通型N,O-sialogycoproteinであるequatorinにおいて、広く保存されたドメインおよび糖鎖の重要性、さらには翻訳後修飾変化を解析するうえで重要な基礎情報となる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
一年目に計画していた内容は達成し、2年目の計画に着手しているが、細胞骨格と相互作用している精子先体膜タンパク質である性質上、相互作用の解析に困難が予想されるため、楽観視することはできない。しかし、多くの分子との相互作用や糖鎖に関わる情報など有用な結果が得られることが期待できるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
質量解析で得られた候補分子とequatorinの相互作用の確認を293T細胞を用いたリコンビナントタンパク質実験により行う。その際、精子成熟過程を経て合成されていないため、先体膜タンパク質として合成された場合と293T細胞によるリコンビナントタンパク質として合成された場合では修飾変化や相互作用の場での生理的条件が異なるという問題点が存在する。そのため、293T細胞を用いた実験としては最低限トランスフェクション効率に依存しない実験をおこなうため、それぞれのリコンビナントタンパク質を安定発現する細胞株を作製する。得られた結果から機能が予想されるドメインに変異を導入したequatorinを発現するマウスを作製することで、最終的には、マウスを用いたin vivo実験で証明を行う。
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