バイオマグネタイト形成の分子機構解明とその応用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13002005
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 松永 是 東京農工大学, 工学部, 教授 (10134834)
• 研究分担者: 神谷 晋司 (株)TDK, 秋田研究所, 研究主任 ; 田中 剛 東京農工大学, 工学部, 助手 (20345333) ; 竹山 春子 東京農工大学, 工学部, 助教授 (60262234) ; 須藤 広明 (株)日立製作所, ライフサイエンス推進事業部開発本部, 技師
• キーワード: 磁性細菌 / マグネタイト / bacterial magnetic particle(BMP) / 全ゲノム解析 / バイオインフォマティクス / トランスクリプトーム / プロテオミクス / ゲノム創薬

研究概要

平成14年度は、磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB-1の全ゲノム解析を終了した後、研究計画に記した各項目について同時並行的に解析・開発に取り組んだ。以下に各項目別にその成果を示す。
1.磁性細菌M. magneticum AMB-1の全ゲノム配列決定とバイオインフォマティクス
塩基配列解析の結果から、GeneMarkプログラムによって、遺伝子の推定を行い、4576個のORFが見出された。推定されたORFの配列について、COGs、SWISS-PROTの各データーベースに対しホモロジー検索し、機能予測を行った。
2.トランスホゾンを用いた変異解析およびバイオマグネタイト合成能欠損株のプロファイル
5762株に及ぶ全ミュータント中、バイオマグネタイト合成能欠損株は69株であった。このうち、53株については、全ゲノムに対してマッピングし、バイオマグネタイト合成能欠損株のプロファイリングを行った。変異株の1つNMA21は嫌気型酵素アルデヒド酸化還元酵素およびその補酵素合成に関与する遺伝子のオペロンを形成していた。この酵素が、鉄の酸化還元に関与してバイオマグネタイト合成を調節している可能性が考えられた。
3.バイオマグネタイト包膜に結合している膜タンパク質の網羅的同定
AMB-1株から分離したバイオマグネタイトから膜タンパク質を可溶化し、二次元電気泳動で展開後、100を越えるスポットのN末端アミノ酸シークエンスを決定した。この結果をAMB-1株のデーターベースを用いて遺伝子配列および相同性解析を行った。
4.バイオマグネクイトに直接結合しているタンパク質の分離および機能解析
2 M HF,8 M NH_3F(pH5.0)を用いてマグネタイトを溶かし、溶解物を解析した結果、粒子に強固に結合する低分子量タンパク質が見出された。また、磁性細菌粒子内部からはタンパク質は検出されなかった。機能解析のため、特に酸性タンパク質であるMms6に着目し、大腸菌においてMms6の大量調製を行った。精製されたMms6を用いて共沈法によるマグネタイト合成を行った。電子顕微鏡観察から、Mms6存在下で合成されたマグネタイトは粒径5-50nmの形の整った粒子であることが観察された。このことより、Mms6は磁性細菌粒子の形状制御に直接関与していることが考えられた。
5.DNAチップを用いた遺伝子発現解析
上述の2,3の成果およびバイオマグネタイト自然欠損ミュータントが欠損したゲノム領域にコードされている遺伝子をマウントしたDNAチップを設計し、磁気微粒子合成が促進される鉄過剰条件と、磁気微粒子が合成されない3条件(好気・鉄欠乏・硝酸欠乏)において培養された菌体のmRNAの発現量と、通常培養におけるmRNAの発現量を比較して、13個の変動遺伝子を同定した。これらの同定された遺伝子がバイオマグネタイト合成に強く関与している可能性が示唆された。
6.Mms16タンパク質のアンカー分子としての機能性の評価と膜タンパク質ディスプレイ
本研究では膜アンカリング型のタンパク質に膜貫通型の外来膜タンパク質をディスプレイすることを検討した。他の多くのディスプレイシステムは、膜タンパク質のディスプレイはマテリアルの性質上、不得意とされている。本研究では膜アンカリング型Mms16のアンカー分子としての有効性を評価した。さらに7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体の1つであるドーパミンレセプターをディスプレイし、リガンドとの結合解析を行うことで、機能を保持した膜タンパク質のディスプレイ系を開発することを目的とした。D1ドーパミンレセプター(D1)遺伝子とmms16遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド(pUMl6D1)を構築し、組み換え磁性細菌粒子を得た。抗D1抗体を用いて、粒子表面にD1の発現の局在が確認された。またこれらのリガンド結合能は保持されていた。さらにBodipy標識アンタゴニスト存在下で非標識のドーパミンと競合反応を行ったところ、10^<-6>10^<-3>Mの濃度範囲においてドーパミンの定量が可能であった。

研究成果

• [文献書誌] Atsushi Arakaki, Haruko Takeyama, Tsuyoshi Tanaka, Tadashi Matsunaga: "Cadmium Recovery by a Sulfate-Reducing Magnetic Bacterium, Desulfovibric magneticums RS-1 Using Magnetic Separation"Appl.Biochem.Biotechnol.. 98/100. 833-840 (2002)
• [文献書誌] Kimimichi Obata, Hideji Tajima, Masafumi Yohda, Tadashi Matsunaga: "Recent Developments in Laboratory Automation Using Magnetic Particles for Genome Analysis"Pharmacogenomics. 3. 697-708 (2002)
• [文献書誌] Tadashi Matsunaga, Fumiko Ueki, Kimimichi Obata, Hideji Tajima, Tsuyoshi Tanaka, Haruko Takeyama, Yasuhiro Goda, Shigeru Fujimoto: "Fully Automated Immunoassay System of Endocrine Disrupting Chemicals Using Monoclonal Antibodies Chemically Conjugated to Bacterial Magnetic Particles"Anal Chim Acta. 475. 75-83 (2003)
• [文献書誌] Ronie J.Calugay, Hideaki Miyashita, Yoshiko Okamura, Tadashi Matsunaga: "Siderophore Production by the Magnetic Bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1"FEMS Microbiol.Lett.. 218. 371-375 (2003)
• [文献書誌] Atsushi Arakaki, John Webb, Tadashi Matsunaga: "A Novel Protein Tightly Bound to Bacterial Magnetic Particles in Magnetospirillum magneticum Srain AMB-1"J.Biol.Chem.. 278. 8745-8750 (2003)
• [文献書誌] Brandon Yoza, Atsushi Arakaki, Kohei Maruyama, Haruko Takeyama, Tadashi Matsunaga: "Fully Automated DNA Extraction from Blood using Magnetic Particles Modified with Hyperbranched Polyamidoamine Dendrimer"Biosens.Bioelectron.. 95. 21-26 (2003)
• [文献書誌] Atsushi Arakaki, Haruko Takeyama, Tsuyoshi Tanaka, Tadashi Matsunaga: "DNA Extraction Using Bacterial Magnetic Particles Modified with Hyperbranched Polyamidoamine Dendrimer"J.Biotechnol.. 101. 219-228 (2003)
• [文献書誌] Aris Tri Wahyudi, Haruko Takeyama, Yoshiko Okamura, Tadashi Matsunaga: "Aldehyde Ferredoxin Oxidoreductase is Linked to the Bacterial Magnetic Particle Synthesis in the Magnetic Bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1"Biochem.Biophys.Res.Commun.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Tomoko Yoshino, Tsuyoshi Tanaka, Haruko Takeyama, Tadashi Matsunaga: "Single nucleotide polymorphism genotyping of aldehyde dehydrogenase 2 gene using a bacterial magnetic particle"Biosens.Bioelectron.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Hiroyuki Ota, Haruko Takeyama, Hideki Nakayama, Takahiko Katoh, Tadashi Matsunaga: "SNP Detection in Transforming Growth Factor-β1 Gene using Bacterial Magnetic Particles"Biosens.Bioelectron.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Tsuyoshi Tanaka, Kohei Maruyama, Kiyoushi, Etsuo Nemoto, Yuuji Udagawa, Hideki Nakayama, Haruko Takeyama, Tadashi Matsunaga: "Development and Evaluation of Automated Workstation for Single Nucleotide Polymorphism Discrimination Using Bacterial Magnetic Particles"Biosens.Bioelectron.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Tadashi Matsunaga, Yoshiko Okamura: "Molecular Mechanism of Bacterial Magnetite Formation and Its Application"Mat.Res.Soc.Symp.Proc.. 724. N1.4.1-N1.4.13 (2002)
• [文献書誌] Tadashi Matsunaga, Yoshiko Okamura: "Bio-Nanomagnet and its Application"Int.J.Nanosci.. (in press).
• [文献書誌] 松永 是, 田中 剛: "動態制御工学とマイクロマシン, DDS"Drug Delivery System. 18. (2003)
• [文献書誌] 松永 是: "マイクロからナノのバイオテクノロジー"数理科学. 478. 78-83 (2003)