NADPHオキシダーゼコンポーネントp47^<phox>のSH3Aドメインの構造解析 ―部位特異的スピンラベル法と飽和移動法による研究―

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13014202
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 稲波 修 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (10193559)
• 研究分担者: 下山 雄平 北海道教育大学, 教育学部, 教授 (50123948) ; 桑原 幹典 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (10002081)
• キーワード: 好中球 / NADPHオキシダーゼ / 突然変異 / マレイミド / 部位特異的スピンラベル法 / 電子スピン共鳴法 / リン酸化 / 蛋白リン酸化酵素

研究概要

NADPHオキシダーゼは好中球に存在し、スーパーオキサイドを生成する酵素として知られている。このNADPHオキシダーゼは感染防御にとって非常に重要であると認識されており、細胞膜に局在するp22^<phox>とgp91^<phox>、細胞質に局在するp47^<phox>、p67^<phox>ならびにracから構成されることが知られている。活性化に際しては、FcRやFMLP刺激によって活性化したprotein kinase C(PKC)がp47^<phox>のC末端領域のリン酸化を促し、リン酸化p47^<phox>の二つのSH3ドメイン(SH3(N),SH3(C)とプロリンリッチ領域(PRR)が、それぞれp22^<phox>とp67^<phox>と結合し、膜に会合し、活性を表すと考えられている。本研究では、システイン残基をターゲットとした3-malemide-proxylをスピンプローブとして用いたスピンラベル法を用い、リン酸化に伴うp47^<phox>の構造変化を解析した。wild typep47^<phox>のESRスペクトルはラベルされたN-oxylの早い運動を示すunimmobilizedコンポーネントと運動の抑制を示すimmobilizedコンポーネントが観察された。C378Aの変異蛋白ではunimmobilizedコンポーネントのみが消失した。またC196Aの変異蛋白質ではimmobilizedコンポーネントが消失した。このことから、unimmobilizedコンポーネントはC379に由来し、C末端付近のSH3(C)ドメイン付近の構造変化に起因することが推察された。またimmobilizedコンポーネントはC196に由来し、SH3(N)ドメイン付近の構造変化に由来することを示唆している。また、unimmobilizedコンポーネントはPKCによりリン酸化されることにより運動性が抑制されることが明らかとなった。飽和移動法を用いることで、リン酸化でさらに運動性の抑制が観察された。以上の結果より、SH3(C)ならびにSH3(N)は、リン酸化で、共にrigidな構造変化を起こしており、これが、NADPHオキシダーゼ活性化のためのシグナル伝達に重要であることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] T.Yamamori: "Roles of p38 MAPK, PKC and PI3-K in the signaling pathways of NADPH oxidase activation and phagocytosis in bovine polymorphonuclear leukocytes"FEBS Letter. 467. 253-258 (2001)
• [文献書誌] M.Tsuji: "Induction of neurite outgrowth in PC12 cells by α-phenyl-N-tert-butylnitron through activation of protein kinase C and the Ras-extracellular signal-regulated kinase pathway"Journal of Biological Chemistry. 276. 9400-9605 (2001)
• [文献書誌] K.Iwasaki: "Kuwabara and M. Niiyama, Isolation, characterization, and cDNA cloning of chicken turpentine-induced protein, a new member of the scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) family of protein"Journal of Biological Chemistry. 276. 9400-9405 (2001)
• [文献書誌] H.Abe: "Superoxide generation from human polymorphonuclear leukocytes by liposome-encapsulated hemoglobin"Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 29. 275-283 (2001)
• [文献書誌] K.Niwa: "p38 MAPK and Ca^<2+> contribute to hydrogen peroxide-induced increase of permeability in vascular endotherial cells but ERK does not"Free Radical Research. 35. 519-527 (2001)
• [文献書誌] I.Kashiwakura: "Effects of amifostine on the proliferation and differentiation of megakaryocytic progenitor cells"Europearn Journal of Pharmacology. 437. 19-25 (2002)
• [文献書誌] 桑原幹典: "一重項酸素により誘導されるアポトーシスシグナル伝達"医学のあゆみ. 別冊. 86-88 (2001)
• [文献書誌] K.Takahashi: "Protein synthesis-dependent apoptotic signalling pathway in X-irradiated MOLT-4 human leukaemia cell. line"International Journal of Radiation Biology. 78. 115-124 (2002)
• [文献書誌] O.Inanami: "Hypoxia and etanidazol alter radiation-induced apoptosis in HL60 cells but not MOLT-4 cells"International Journal of Radiation Biology. (印刷中).