| 研究課題/領域番号 |
13022223
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| 研究種目 |
特定領域研究(A)
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
岡畑 恵雄 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 教授 (80038017)
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| 研究分担者 |
川崎 剛美 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (60334504)
森 俊明 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教授 (50262308)
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| キーワード | 水晶発振子 / DNA鎖の伸長 / ポリメラーゼ / ミカエリス-メンテン式 |
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| 研究概要 |
本研究は、水晶発振子マイクロバランス法を用いて生体中でおこる微細な各反応を質量変化としてとらえ、シンクロナイズされた全反応を定量的に評価することを目的として、以下の結果を得た。
1)27MHz水晶発振子の金電極表面にピオチン-アビジン法を用いてプライマー/テンプレート部をもつDNA鎖を固定化し水溶液中にポリメラーゼ(大腸菌由来のklenow fragment)とモノマー(dGTP or dATP)を加え、DNAのポリメラーゼ反応を振動数(重量)変化として追跡した。
2)各素過程はシンクロナイズされて進行するので、酵素のDNA鎖への結合過程(K_a/M^<-1>),テンプレート鎖に沿った重合過程(Km.k_<cat>)および重合したDNA鎖からの脱離過程(K_d/M^<-1>)の動力学定数を求めた。その結果、酵素のDNA鎖への結合定数はKa=10^5M^<-1>と求まり、DNA鎖の伸長反応はミカエリス-メンテン式に従い、Km=20μM、k_<cat>=10S^<-1>と求まった。また、伸長が終わった後酵素はDNA鎖から離れることが明らかとなった。これは伸長が終わったDNA鎖への酵素の結合定数がK_a=10^3M^<-1>と小さくなるためであることがわかった。
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