酵素免疫測定法の高感度化を目的とした分子シンクロナイゼーション系の構築と応用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13022236
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• キーワード: 分子シンクロナイゼーション / 分子間相互作用 / 酵素免疫測定法 / 酵素 / 抗体 / 臨床診断 / 食品分析 / ヒスタミン

研究概要

ヒスタミン(HA)は神経伝達、胃液分泌、アレルギー反応に関与する生理活性アミンであり、食品衛生においては魚の鮮度マーカーである。分子シンクロナイゼーション系を組み込んだHAの高感度酵素免疫測定法EIAの構築を検討した。HAに対するモノクローナル抗体AHA2を獲得し、AHA2とHAとの相互作用を表面プラズモン共鳴法により解析した。AHA2の作出に用いた抗原HA-GA-BSAとAHA2との相互作用解離定数Kdは1nMであるが、HAとのKdは1μMであった。この差異はAHA2がHAと架橋剤GAとの結合部位をも認識する結果であると考えられた。HAにGAを共有結合させたHA-GAに対するAHA2の結合力は、HAに対する結合力に比べてl00倍増大したが、HA-GA-BSAの結合力に比べてかなり弱かった。AHA2と各種HA類縁体[His,α-methyl His,1-methylHA,3-methylHA, GABA]との交差反応性を検討した。AHA2はこれら類縁体とほとんど相互作用を示さなかった。一方、昨年度開発した3酵素反応シンクロ系を改良して、化学発光検出系を用いる4酵素系を構築した。ALP(酵素1)標識した第2抗体によりNADPからNADを生成させ、第2酵素ADHによりNADをNADHに変換する。ついで第3酵素NHRによりNADHをNADに変換するとともにFMNをFMNH_2に還元する。FMNH_2は第4酵素ルシフェラーゼによりFMNに変換されるが、このとき脂肪酸アルデヒドが脂肪酸に変換され化学発光を発する。以上のシンクロ系の最適化を検討し、ほぼ応用できる条件を見出すことができた。

研究成果

• [文献書誌] T.Sakaki, N.Sawada, K.Inouye他7名: "Metabolism of 26,26,26,27,27,27-F6-12,25-dihydroxyvitamin D3 by cyp24"Biochemical Pharmacology. (印刷中). (2003)
• [文献書誌] T.Takita, M.Nakagoshi, K.Inouye, B.Tonomura: "Lysyl-tRNA Synthetase from Bacillus stearo-thermophilus"Journal of Molecular Biology. 325. 677-695 (2003)
• [文献書誌] 小根田洋史, 井上國世: "その活性がベル型からはずれたユニークなpH依存性を示す2,3の酵素の例と機能調節"化学と生物. 41(印刷中). (2003)
• [文献書誌] H.Oneda, M.Shiihara, K.Inouye: "Inhibitory effects of green tea catechins on the activity of human matrix・・・"Journal of Biochemistry. 133(印刷中). (2003)
• [文献書誌] 小根田洋史, 井上國世: "α-アミラーゼの工業利用の現状"バイオインダストリー. 19・11. 8-11 (2002)
• [文献書誌] K.Inouye, K.Nagai: "Biochemical trials for expanding the utility of soy proteins"Sugiyama Chemical and Industrial Laboratory Annual Report. 2002. 43-59 (2002)
• [文献書誌] K.Nakamura, T.Suzuki, K.Inorye他4名: "Evaluation and aplication of a new dye affinity adsorbent"Journal of Chromatography A. 972. 21-25 (2002)
• [文献書誌] T.Takita, K.Inouye: "Transition state stabilization by the N-terminal anticoden-binding domain ・・・"Journal of Biological Chemistry. 277. 29275-29282 (2002)
• [文献書誌] A.Tanaka, H.Sugimoto, K.Inouye他4名: "Differential scanning calorimetry of the effects of Ca^<2+> on the thermal・・・"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67. 207-210 (2003)
• [文献書誌] Y.Muta, K.Inouye: "Inhibitory effects of alcohols on thermolysin activity・・・"Journal of Biochemistry. 132. 945-951 (2002)
• [文献書誌] R.Shinkyo, T.Sakaki, K.Inouye他1名: "Metabolic pathways of dioxin by CYP1A1"Archives of Biochemistry and Biophysics. 409. 180-187 (2003)
• [文献書誌] T.Sakaki, R.Shinkyo, T.Takita, K.Inoute他1名: "Biodegradation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins by recombinant・・・"Archives of Biochemistry and Biophysics. 401. 91-98 (2002)
• [文献書誌] K.Inouye, K.Nagai, T.Takita: "Coagulation of soy protein isolates induced by subtilisin Carlsberg"Journal of Agricultural and Food chemistry. 50. 1237-1242 (2002)
• [文献書誌] K.Inouye, I.Ueno, S.Yokoyama, T.Sakaki: "Development of a synchronous enzyme-reaction system for a highly sensitive・・・"Journal of Biochemistry. 131. 97-105 (2002)
• [文献書誌] K.Inouye, R.Shinkyo, 他3名: "Metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) by human ・・・"Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50. 5496-5502 (2002)
• [文献書誌] K.Inouye, M.Shiihara, T.Uno, T.Takita: "Deodorization of soybean proteins by enzymatic and physicochemical・・・"Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50. 1652-1658 (2002)
• [文献書誌] 井上國世, 小根田洋史: "バイオサイエンス系の機器分析"三共出版(印刷中). (2003)
• [文献書誌] 井上國世: "酵素ハンドブック(第3版)"朝倉書店(印刷中). (2003)
• [文献書誌] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology"Marcel Dekker. 1108 (2003)