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本研究は、藍藻に存在する概日リズムの分子モデルの中で、Pexタンパク質の機能を追求することを目的としている。
本年度はまずタンパク質研究の準備として、Pexタンパク質の大量発現と精製を行った。Pexタンパク質を大量に得るために、Glutathione-S-transferase(GST)をN末端側につけた融合タンパク質として大腸菌体内で大量に発現する条件を見つけた。大腸菌細胞破砕液からグルタチオンカラムを用いてGST融合Pexタンパク質を精製し、さらに特異的プロテアーゼを用いてGSTタグから切り離して純粋なPexタンパク質を得ることに成功した。また、藍藻内の微量タンパク質を検出するために、Pexのポリクローナル抗体を作製した。抗体は、アミノ酸配列から抗原性の高い配列を推定し、この配列に相当する合成ペプチドをウサギに免役して抗Pex抗血清を得た。この抗血清からProteinAアフィニティーカラムを用いてIgG画分を精製した。
次にPexの機能を推定するために、DNA結合活性が見られるかどうかを検討した。藍藻の時計遺伝子にはkaiA、kaiB、kaiCがあることが知られているが、PexはこのうちkaiA発現を調節することが明らかになったため、kaiAORFの上流領域DNAと精製Pexタンパク質が結合するかどうかをゲルシフトアッセイを用いて調べたところ、PexはkaiA上流領域DNAに結合した。Pexによって制御をうけない領域のDNAには結合しなかった。今後はin vivoでもPexタンパク質がkaiAの発現を直接調節しているのか検討する予定である。
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