| 研究概要 |
今年度は、ブラシノステロイド不活性化に関わるP450を酵素化学的に解析することを中心として実験を進めた。これまでにトマトからブラシノステロイド生合成に関わるP450(CYP90A, B, C)と不活性化に関わる新規CYP72B2および72B3の全長cDNAを単離した。トマトをブラシノステロイド処理すると生合成遺伝子の転写量は減少したのに対し、CYP72B2および72B3の転写は増加した。また72B2cDNAをタバコで過剰発現させたところ矮性表現型を示した。内生ブラシノステロイド含量をGC-MSにより定量し野生株と比較したところ、組換え体においてカスタステロンが顕著に減少していたことから、過剰発現している72B2がカスタステロンを不活性化したために矮化していることが示唆された。昆虫細胞ムバキュロウイルス発現系により作製した72B2酵素を用いて生合成中間体に対する基質結合アッセイを行った結果、72B2はカスタステロンに対して強い親和性(6μM)を示したが、一方、活性型ブラシノライドや生合成前駆体6-デオキソカスタステロンはやや弱い親和性(11μM)しか示さなかった。そこで、72B2酵素を発現している昆虫細胞のミクロソーム膜を用いてNADPH-P450還元酵素共存のもとで代謝実験を行った。カスタステロンを基質として酵素アッセイを行った結果、GC-MSにより水酸化生成物を検出する事ができた。MS解裂パターンからカスタステロンの側鎖に水酸基が一つ導入されていることが示された。現在、生成物を分取してNMRによる構造解析を進めている。
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