トランスポーター膜蛋白質の機能解明を目指した活性天然物の探索

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13024249
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小林 資正 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (40116033)
• キーワード: がん多剤耐性 / P-glycoprotein / MRP1 / agosterol A / 光親和性標識

研究概要

1)P-gpを過剰発現するKB-C2株とMRP1を過剰発現するKB-CV60株に対する耐性克服物質として発見したagosterol Aに^<125>Iとアジド基を有する光親和性補助基を11位水酸基に5炭素のリンカーを介して結合させたラジオアイソトープ標識光親和性プローブを設計・合成することに成功した。
2)合成した光親和性プローブを用いてMRP1に対する標識実験を行った結果、MRP1を効率よく標識でき、MRP1の基質輸送の際に必須であるグルタチオン(GSH)の存在下のみにMRP1を標識できるという優れた選択性も有していることが明らかになった。また、GSHのかわりにmethyl-S-GSHを用いても同様にMRP1を標識できたが、ethyl-S-GSHを用いると標識は半分程度に減少し、octyl-S-GSHを用いた際にはまったく標識できなかった。さらに、GSH存在下のMRP1に対する標識において、octyl-S-GSHを共存させると標識がoctyl-S-GSHの濃度依存的に拮抗阻害された。これは、かさ高いoctyl-S-GSHが基質の結合部位への接近を阻害したためと考えられ、この結果から、GSHの結合部位と基質の結合部位が近い位置に存在することが推定された。
3)本プローブを用いてMRP1を標識後、限定加水分解し、分解物をSDS-PAGEで分離解析した結果、本プローブの結合部位は、MRP1のC末端側に存在することが判明した。さらに、MRP1の1202番目のアルギニンをグリシンに置換した変異体および1249番目のアルギニンをアラニンに置換した変異体を作成し、基質輸送能の検討および標識実験を行った結果、R1202Gは基質輸送能を保持しており標識もされたのに対して、R1249Aは基質輸送能が大幅に減弱し標識もされなかった。以上の結果から、MRP1の基質認識には1249番目のアルギニンが重要であると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Shunji Aoki, Motomasa Kobayashi et al.: "Reversing Effect of Agosterol A, a Spongean Sterol Acetate, on Multidrug Resistance in Human Carcinoma Cells"Jpn.J.Cancer Res.. 92. 886-895 (2001)
• [文献書誌] Shunji Aoki, Motomasa Kobayashi et al.: "Brianthein A, a novel briarane-type diterpene reversing multidrug resistance in human carcinoma cell line, from the gorgonian Briareum excavatum"Tetrahedron. 57. 8951-8957 (2001)
• [文献書誌] Zhe-Sheng Chen, Motomasa Kobayashi et al.: "Reversal of drug resistance mediated by multidrug resistance protein (MRP) 1 by dual effects of agosterol a on MRP1 function"International Journal of Cancer. 93. 107-113 (2001)
• [文献書誌] Xiao-Qin Ren, Motomasa Kobayashi et al.: "Glutathione (GSH) Dependent Binding of a Photoaffinity Analog of Agosterol A on the C-terminal Half of Human Multidrug Resistance Protein (MRP1)"J.Biol.Chem. 276. 23197-23206 (2001)
• [文献書誌] Xiao-Qin Ren, Motomasa Kobayashi et al.: "A Positively Charged Amino Acid Proximate to the C-terminus of TM17 of MRP1 is Indispensable for GSH-dependent binding of Substrates and for Transport of LTC4"Biochemistry. 41. 14132-14140 (2002)