疎水性相互作用を利用した人工タンパク質の設計

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13031023
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 小畠 英理 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教授 (00225484)
• キーワード: 疎水性相互作用 / 人工タンパク質 / 細胞接着 / 細胞分化 / エラスチン / RGD配列 / 細胞外マトリックス / 骨芽細胞

研究概要

本研究では、疎水性相互作用に着目したタンパク質の分子設計を行い、特殊環境耐性を有する安定な機能性人工タンパク質材料を構築することを目的とする。本年度の研究では、細胞機能制御部位を有する新規タンパク質を設計した。このタンパク質は、細胞機能制御部位として細胞接着活性能部位、および細胞分化誘導能部位を有している。また、これらの機能部位が細胞に作用するために構造保持部位として高度に疎水的なアミノ酸配列を用い、細胞外マトリックスを形成するように設計した。これらの機能、構造保持部位は、既存のタンパク質の部位を利用しているため、本研究で設計したタンパク質は生体親和性を保持した新規細胞外マトリックスとしての利用が期待される。
細胞接着活性を有する部位としてRGD配列(RGD)、細胞分化を誘導する部位として骨芽細胞の分化を誘導するosteogenic growth peptide(OGP)、そしてこれらの機能部位を支え、細胞外マトリックスを形成するための構造保持部位としてエラスチン由来のヘキサペプチド(APGVGV)を12回繰り返した配列(E12)を利用し、これらを組み合わせて細胞機能制御部位を有するタンパク質ERE-OGPを設計した。このタンパク質は、大腸菌体内で合成・精製した。
ERE-OGP、E12、およびフィブロネクチンをそれぞれ疎水的な表面をもつプレートにコーティングし、BSAでブロッキングした。マウス頭頂骨由来の骨芽細胞(MC3T3-E1)をまき、90分後、接着していない細胞を取り除き、顕微鏡視野内において一定の面積領域に存在する接着細胞数をカウントした。その結果、ERE-OGPはフィブロネクチンと同程度の細胞接着活性を有すること、RGD配列を持たないE12では接着活性は低下することが示された。以上の結果から、導入したRGD配列が有効に機能し、細胞接着に寄与していることが示された。またアルカリフォスファターゼ活性測定を行い、骨芽細胞の分化誘導能を評価した。

研究成果

• [文献書誌] T.Ebihara, H.Takayama, Y.Yanagida, E.Kobatake, M.Aizawa: "Thermostabilization of protein A-luciferase fusion protein by single amino acid mutaion"Biotechnol.Lett.. 24. 147-149 (2002)
• [文献書誌] G.H.Seong, E.Kobatake, K.Miura, A.Nakazawa, M.Aizawa: "Direct atomic force microscopy visualization of integration host factor-induced DNA bending structure of the promoter regulatory region on the pseudomonas TOL plasmid"Biochem.Biophys.Res.Commum.. 291. 361-366 (2002)
• [文献書誌] H.Funabashi, T.Haruyama, M.Mie, Y.Yanagida, E.Kobatake, M.Aizawa: "Non-destructive monitoring of rpoS promoter activity as stress marker for evaluating cellular physiological status"J.Biotechnol.. 95. 85-93 (2002)
• [文献書誌] F.Takahashi, T.Ebihara, M.Mie, Y.Yanagida, Y.Endo, E.Kobatake, M.Aizawa: "Ribosome display for selection of active dihydrofolate reductase mutants using immobilized methotrexate on agarose beads"FEBS.Lett.. 514. 106-110 (2002)
• [文献書誌] G.H.Seong, Y.Yanagida, M.Aizawa, E.Kobatake: "Atomic force microscopy identification of transcription factor NFkB bound to streptavidin-pin-holding DNA probe"Anal.Biochem.. 309. 241-247 (2002)
• [文献書誌] T.Ebihara, M.Aizawa, E.Kobatake: "Direct sensing of ligand-protein interaction by counting of bioaffinity beads with atomic force microscopy"Biotechnol.Lett.. 24. 1605-1609 (2002)