強相関バイオサーファクタントの油水分離機構の基本原理とその利用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13031047
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 跡見 晴幸 京都大学, 工学研究科, 助教授 (90243047)
• キーワード: Rubisco / subunit間相互作用 / イオン結合 / 超好熱菌 / 始原菌 / Thermococcus / タンパク質の立体構造 / 耐熱性

研究概要

T.kodakaraensis KOD1株のRubisco(Tk-Rubisco)は1次構造上既存のTypeI、TypeIIのどちらにも属さない新型Rubiscoである。組換え型酵素を用いてTk-Rubiscoの立体構造解析を進めた結果、本酵素はL_2 dimerを構成単位にもつ直径約150Åの平面的なpentagonal decamer構造をとっていることが明らかとなった。Tk-RubiscoのL_2 dimer間の相互作用領域は既存の酵素のものと全く異なっており、Glu63,Arg66,Asp69を中心としたイオン結合ネットワークが観察された。Subunit間のイオン結合性相互作用のメカニズムを生化学的に解明するために、これら3つのアミノ酸を一つずつSerに置換した変異体(E63S、R66S、D69S)および3残基を同時に置換した変異体(E63S/R66S/D69S)を作製し、各々のタンパク質を精製した。その結果、30℃においてはD69S、E63Sは野生型と同じ10量体、R66Sは10量体と2量体の混合物、E63S/R66S/D69Sは2量体の形で存在していることが明らかとなった。温度上昇に伴い、E63SおよびR66Sの10量体構造は徐々に解離し、4量体や2量体構造へと変化した。D69S変異体のみ90℃においても10量体構造を維持した。そこで微少熱量計や円二色計を用いて各変異体酵素の耐熱性を比較した。興味深いことに、90℃までに10量体構造が解離して2量体となったE63S、R66SおよびE63S/R66S/D69S変異体は95℃付近で熱変性したのに対し、90℃まで10量体構造を維持したWTおよびD69Sは約110℃まで安定に存在した。これらの結果から、Tk-Rubiscoの五角形10量体構造は本酵素の耐熱性に大きく寄与していることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] T.Fukui, Tomohiro Eguchi, H.Atomi, T.Imanaka: "A membrane-bound archaeal Lon protease displays ATP-independent proteolytic activity towards unfolded proteins along with ATP-dependent"J. Bacteriol.. 184(13). 3689-3698 (2002)
• [文献書誌] N.Rashid, H.Imanaka, T.Kanai, T.Fukui, H.Atomi, T.: "A novel candidate for the true fructose 1,6-bisphosphatase in archaea"J. Biol. Chem.. 277(34). 30649-30655 (2002)
• [文献書誌] N.Maeda, T.Kanai, H.Atomi, T.Imanaka: "The unique pentagonal structure of an archaeal Rubisco is essential for its high thermostability"J. Biol. Chem.. 277(35). 31656-31662 (2002)
• [文献書誌] H.Imanaka, T.Fukui, H.Atomi, T.Imanaka: "Gene cloning and characterization of fructose-1,6-bisphosphate aldolase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus"J. Biosci. Bioeng.. 94(3). 237-243 (2002)
• [文献書誌] Tadayuki Imanaka, Haruyuki Atomi: "Catalyzing 'Hot' Reactions : Enzymes from Hyperthermophilic Archaea"The Chemical Records. 2(3). 149-163 (2002)
• [文献書誌] M.Nakatani, S.Ezaki, H.Atomi, T.Imanaka: "Substrate recognition and fidelity of strand joining by an archaeal DNA ligase"Eur. J. Biochem.. 269(2). 650-656 (2002)
• [文献書誌] Tadayuki Imanaka, Haruyuki, Atomi: "Enzyme Catalysis in Organic Synthesis : A Comprehensive Handbook, 2nd completely revised and enlarged Edition, Ed. by Karlheinz Drauz, Herbert"Rational Design of Functional Proteins. 27 (2002)