カムオペロンの末端酸化酵素と電子供与体たんぱく質の複合体

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13033036
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 島田 秀夫 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (80095611)
• 研究分担者: 堀 洋 大阪大学, 基礎工学研究科, 助手 (20127294) ; 菱木 貴子 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10338022)
• キーワード: シトクロームP450 / カンファー / 部位特異的アミノ酸置換 / 水素イオン輸送 / EPR / プチダレドキシン

研究概要

カンファー水酸化反応は、基質カンファーが酸化型P450camに結合することから始まる。この結合によって、酵素の酸化還元電位が上昇し、その結果、電子供与体プチダレドキシン(Pdx)によって還元される。したがって、両たんぱく質の相互作用は、もっぱら基質存在下で研究された。今回、複合体形成における基質の役割を、還元型PdxのEPRシグナルをプローブとして検討した。基質はP450camとPdxの複合体形成そのものに有意な影響を与えないものの、基質結合が、Pdx結合部位構造を変え、これまで知られていた活性部位構造の変化に加え、その変化がP450cam分子表面にまで及ぶことが初めて明らかになった。
P450の触媒反応には、2等量の水素イオンが必須であるが、どのように水素イオンが酵素内部の活性部位に供給されるのかまだよく解明されていない。昨年P450camの水素イオン取り込み口となるアミノ酸残基、Asp182を見出した。2,3の膜タンパク質で、水素イオンの取り込み口に結合して、水素イオンの取り込みを阻害することが知られているZn2+の効果をP450camで検討した結果、2mMのZn2+で、活性が約50%に低下することがわかった。また1mMのZn2+で、酸化型P450camの吸収スペクトルに変化が見られ、活性部位構造の変化が示された。しかし、吸収スペクトルの変化と活性阻害の関連、またZn2+結合部位は今後の検討課題として残った。
水素イオンが、酵素に取り込まれてAsp182に近接したAsp251に渡り、ヘム鉄に結合した酸素分子に供給される過程に、Asp251とThr252の間のペプチド結合を介した水素イオン輸送が介在する可能性を検討するため、Thr252をプロリンに変え、水素イオンの輸送を困難にすることを考えた。そこで、Thr252をProに置換した変異酵素を大腸菌で発現させ、SDS-PAGEで単一のバンドにまで精製した。基質カンファーが結合した酸化型変異酵素は、野生型と異なり、完全な高スピン型にならず、低スピン型が大部分を占めた。還元型、一酸化炭素化型の光吸収スペクトルは、野生型と変わらなかったが、分子吸光係数は、有意に変化した。また変異酵素の活性は、野生型の15%に低下したことから、変異によって活性部位構造および酵素機能に変化が起きたことが示された。しかし、活性の低下は、どの部分反応の低下なのか、まだ不明で、今後検討すべき課題である。

研究成果

• [文献書誌] 永野 真吾: "プチダレドキシンの結合によって安定化されるP450camの活性型構造"生化学. 74. 1029 (2002)
• [文献書誌] 堀 洋: "気質カンファー存在下でのプリダレドキシン・P450cam複合体:EPR、FTIRを用いた解析"生物物理. 42. S60 (2002)
• [文献書誌] 下方 國稔: "ウシチトクロム酸化酵素のプロトン能動輸送におよぼすAsp51Asn(サブユニットI)変異の影響"生物物理. 42. S62 (2002)
• [文献書誌] 広瀬 修一: "高いカタラーゼ活性を有する西洋ワサビペルオキシダーゼの作製とそおカタラーゼ活性上昇機構の解明"生物物理. 42. (2002)
• [文献書誌] Kunitoshi Shimokata: "Asp51Asn mutation of bovine heart cytochrome c oxidase subunit I"Biochimi.Biophys.Acta EBEC Short Report. 12. 105 (2002)
• [文献書誌] Ryu Makino: "YC-1 Facilitates the Release of the Proximal His Residue in the NO and CO complexes of Soluble Guanylate Cyclase"J.Biol.Chem.. (in press). (2003)
• [文献書誌] S.Neya: "Functional Analysis of Iron Hemiporphycene as the Prosthetic Group of Myoglobin"Inorg.Chem.. 42. 1456-1461 (2003)
• [文献書誌] M.Tanaka: "Activation of Hydrogen Peroxide in Horseradish Peroxidase Occurs within 〜300 ms Observed by a New Freeze-Quench Device"Biophysical J.. 84. 1998-2004 (2003)
• [文献書誌] S.Yoshioka: "Roles of the Proximal Hydrogen Bonding Network in Cytochrome P450cam-Catalyzed Oxygenation"J.Am.Chem.Soc.. 124. 14571-14579 (2002)
• [文献書誌] H.Ishikawa: "NO-induced Activation Mechanism of the Heme-regulated elF2α Kinase"J.Am.Chem.Soc.. 124. 13696-13697 (2002)
• [文献書誌] T.Tosha: "Molecular Mechanism of Electron Transfer Reaction in Cytochrome P450cam-Putidaredoxin : Roles of Gln360 at the Heme Proximal Site"Biochemistry. 41. 13883-13893 (2002)
• [文献書誌] S.Nagatomo: "Changes in the Abnormal α-Subunit upon CO-Binding to the β-Subunits of Hb M Boston : Resonance Raman, EPR, and CD Study"Biophysical Chemistry. 98. 217-232 (2002)