| 研究概要 |
Lonプロテアーゼはタンパク質の分解と共役してATPを加水分解するATP依存性プロテアーゼの一種で,大腸菌などの原核生物からヒトなどの高等哺乳動物に至るまで広くその存在が知られている.原核生物においては細胞質に,真核生物においてはミトコンドリアに存在し,変性タンパク質の除去や細胞分裂,細胞壁合成の制御(原核生物),ミトコンドリアの機能維持(真核生物)などに関わっていることが示唆されている.本研究では,Lonプロテアーゼ自体のATP依存的ペプチド結合切断のメカニズムを立体構造レベルで解明することを主な目的とし,これまでに高度好熱菌Lonプロテアーゼ遺伝子のクローニングとその大量発現・精製系の作成を行ってきた.
今年度は高度好熱菌Lonプロテアーゼについて,タンパク質化学的,およびタンパク質工学的研究を行い,プロテアーゼ活性に関与するアミノ酸残基を推定した.Lonプロテアーゼはシステイン修飾試薬による修飾反応で活性を失うことが知られていた.高度好熱菌Lonプロテアーゼにはシステイン残基は1残基しか存在しないので,それをアラニンに置換したが,活性の変化はわずかであった.そこで,この変異体タンパク質にシステイン修飾試薬を作用させ,修飾された残基を同定したところ,特定の1つのヒスチジン残基だったので,この残基に関する変異体を作成し,確かに活性が低下していることを確認した.また,プロテアーゼ活性中心と推定されているセリン残基ならびに,活性に必要であることが示唆されているリシン残基についてもその変異体タンパク質を作成し,活性がほとんど残っていないことを確認した.以上から,Lonプロテアーゼの活性発現に関する新しい機構を推定している.
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