AMPA型グルタミン酸受容体のエンドサイトーシスの分子機構

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13041045
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 竹居 孝二 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (40322226)
• 研究分担者: 山田 浩司 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80325092) ; 絹田 正裕 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (40135942)
• キーワード: 脳 / 神経 / AMPA受容体 / エンドサイトーシス / グルタミン酸受容体 / 膵β細胞

研究概要

1.膵島β細胞株MIN6のキャラクタライゼイション
膵島β細胞にはAMPA受容体が発現していることが見い出されており、本研究ではAMPA受容体のエンドサイトーシスの機構を解明するためにβ細胞を用いることを提案した。
まず特異的抗体を用いたWestern blot法により、MIN6におけるAMPA受容体の発現を明らかにした。次にMIN6におけるエンドサイトーシス機能タンパクの発現を調べた。その結果、クラスリン依存性エンドサイトーシスの機能タンパクであるアンフィファイジン、さらにアンフィファイジンのリン酸化酵素CDK5が高発現することがWestern blot法により見い出された。
2.エンドサイトーシスのin vitro再構成系の確立
AMPA受容体エンドサイトーシスの分子メカニズム解明のためには、エンドサイトーシスによる取り込み小胞の形成をin vitroで再現する実験系の確立が必要であると考えた。In vitroで人工脂質膜(リポソーム)を膜成分として、ATPおよびGTP存在下に細胞質と反応させることにより、大型(直径>1μm)のリポソームから直径100nm以下の小胞が多数形成される実験系を確立した。さらに、形成された小胞の大きさ、数、相対的質量を動的光拡散測定装置を用いて測定することにより、小胞形成の定量化を可能とした。この実験系はAMPA受容体の選択的取り込みを解析するための実験系として応用されうる。

研究成果

• [文献書誌] M.Kinuta: "Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate stimulates vesicle formation from liposomes by brain cytosol"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99. 2842-2847 (2002)
• [文献書誌] K.Farsad: "Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin-bilayer interactions"J. Cell Biol.. 155. 193-200 (2001)
• [文献書誌] Y.Nemoto: "Characterization of synaptojanin 2β isoforms expressed in brain and tests"J. Biol. Chem.. 276. 41133-41142 (2001)
• [文献書誌] K.Takei: "Clathrin-mediated endocytosis : membrane factors pull the trigger"Trends in Cell Biol.. 11. 385-391 (2001)
• [文献書誌] H.Yamada: "Norepinephrine-evoked 5-Hydroxytryptamine secretion is Ca^<2+> dependent and mediated through exocytosis in rat pinealocytes"J.Neurochem. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] M.Kinuta: "Determination of S-[2-carboxy-1-(1H-imidazol-4-yl) ethyl]glutathione, a novel metabolite of L-histidine, in tissue extracts from sunlight-irradiated rat by capillary electrophoresis"Electrophoresis. 22. 3365-3370 (2001)