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低分子量G蛋白質のRhoは細胞の形態や細胞膜のラッフリング、平滑筋の収縮、細胞凝集、細胞運動、細胞質分裂を制御している蛋白質である。この研究は低分子量G蛋白質RhoAとそのRhoAのシグナル伝達経路に関与する蛋白(特にRho kinase)の活性を生細胞でリアルタイムに視覚化し、低分子量G蛋白質とそのカスケードの機能をin vivoで解析することを目的としている。
計画は2年度にまたがっており本年度の計画ではRhoAプローブの開発を主に行うことになっている。
RhoAおよびRho kinaseのcDNAをマウスの脳よりクローン化した。またRhoAの遺伝子に14Vや19Nといった突然変異を導入してconstitutive activeな遺伝子、dominant negativeな遺伝子を作製した。これらを2種類の色の異なるGreen Fluorescent Protein(GFP)と結合させ原理的にFluorescent Resonance Energy Transfer(FRET)を用いるRhoAプローブを作成した。作成されたプローブはHEk293細胞およびHela細胞にtransfection法により発現させ、CCDカメラおよびレーザー顕微鏡を用いて蛍光測定をおこなって、プローブの生細胞内での蛍光変化を検討した。現在プローブの性能をさらに上げるために各機能ドメインの結合部位の配列やつなぎ方の改良と調整を行っている。
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