フラビン依存性酵素の反応制御と新規反応の設計

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13125206
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 三浦 洌 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 教授 (70093466)
• 研究分担者: 玉置 春彦 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 助手 (80264290) ; 瀬戸山 千秋 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 助教授 (60040250) ; 二科 安三 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 助教授 (50112553)
• キーワード: フラビン酵素 / 中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ / 結晶構造解析 / 人工フラビン / 酵素-基質複合体

研究概要

【人工フラビンで再構成したアシルCoAデヒドロゲナーゼによる新規反応の開発と基質結合状態の解析】中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ(MCAD)はFADを補酵素とするフラビン酵素である.MCADを,8位を種々の置換基(8-CN,8-Cl,7,8-Cl_2,8-NH_2,8-OCH_3)で置換した人工FADで再構成した.これらの再構成MCADは新規な反応性を示し,コンポジットMCADの作製に成功した.とくに,これらの再構成MCADのなかで,8-CN-FAD-MCADは,シアノ基の電子吸引性のために,天然のMCADの基質とはならないプロピオニルCoAや,3-ケトオクタノイルCoAを脱水素することができるようになった.また,8-NH_2-FAD-MCADは,アミノ基の電子供与性のために,基質が結合しても触媒反応が進行せず,「酵素-基質複合体」が形成される.そこで,8-NH_2-FAD-MCAD-基質複合体の分光学的諸性質(電子スペクトル,FT-IRスペクトル等)を調べ,基質活性化の詳細を知ることができた.
【8-NH_2-FAD-MCAD-基質複合体の結晶構造解析】
8-NH_2-FAD-MCAD-基質複合体は,アミノ基の電子供与性によって安定に存在することができる.この複合体の結晶構造解析に成功した.この複合体は,酵素-基質複合体と同等のものである.この構造の分解能は1.6Åで,MCADの結晶構造の中ではもっとも高い分解能であり,基質の活性部位におけるコンホメーションと,基質とタンパク質との相互作用,基質とフラビンの相互配置を正確に把握することができた.すなわち,基質(オクタノイルCoA)のC(1)=Oは強い二つの水素結合によって分極され,その結果,基質α位のプロトンのpKa値が低下する様子が確認できた.さらに,触媒塩基であるGlu376-COO-が基質α位のproR-プロトンに接近していること,基質β位の水素がフラビンのN(5)に接近していることなどが明確になり,従来から推定されていた,反応機構の構造的基盤を明らかにすることができた.

研究成果

• [文献書誌] Yasuzo Nishina: "Molecular mechanism of the drop in the pKa of a substrate analog bound to medium-chain acyl-CoA dehydrogenase : Implications for substrate activation."Journal of Biochemistry. 134. 835-842 (2003)
• [文献書誌] Atsuko Satoh: "Structure of the transition state analog of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase.Crystal structure and molecular orbital studies on the charge-transfer complex of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase"Journal of Biochemistry. 134. 297-304 (2003)
• [文献書誌] 三浦洌: "フラビン酵素における反応制御の構造的基盤"ビタミン. 77. 313-320 (2003)
• [文献書誌] 三浦洌: "フラビン酵素と酸素の接点.オキシダーゼとデヒドロゲナーゼの選別"化学と生物. 42. 120-126 (2004)
• [文献書誌] Jung-Ja p.Kim: "Acyl-CoA dehydrogenases and acyl-CoA oxidases.Structural basis for mechanistic similarities and differences"European Journal of Biochemistry. 271. 483-493 (2004)