ヘムを基礎とする高機能複合たんぱく質の創製とその支援研究―水酸化酵素P450のオーダーメイド化―

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13125208
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 島田 秀夫 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (80095611)
• 研究分担者: 林 高史 九州大学, 大学院・工学研究院, 助教授 (20222226) ; 向井 邦晃 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80229913) ; 江川 毅 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10232935) ; 藤井 浩 岡崎国立共同研究機構, 統合バイオサイエンスセンター, 助教授 (80228957)
• キーワード: シトクロムP450 / オーダーメイド / 水素イオン供給 / ミオグロビン / 過酸化水素 / ペルオキシゲナーゼ / ポルフィセン / 亜硝酸イオン還元酵素

研究概要

島田らは、P450のオーダーメイド化に平行してP450の触媒反応機構の解明に努めている。P450においては、反応に必要な2等量の水素イオンが活性部位に供給される仕組みがまだよく解明されていない。そこで数多くのP450の中で最もよくその構造と機能の関連が明らかになっているカンファー水酸化反応を触媒するP450camを対象とし、水素イオン供給系を研究した。本酵素においては、すでに内部の活性部位から分子表面近くに延びた水素結合のネットワークの存在と、それを介しての水素イオンの供給を我々は提唱している。本年度、酵素分子表面のアスパラギン酸残基を介して水素イオンがそのネットワークに輸送されることをほぼ明らかにした。同時に変異酵素の研究から、P450の水素イオン取り込み機構は、P450camで今回明らかにされた機構に加え、直接水分子が内部の水素結合のネットワークに水素イオンを供給する少なくとも二つの機構が存在しうることが示唆された。
また酸素と可逆的に結合するミオグロビンは、過酸化水素と反応させると0-0結合の切断反応を起こし活性酸素原子を生じて有機化合物のperoxygenase反応を触媒する。したがってP450による一原子酸素添加反応の格好のモデルとなる。今回このミオグロビンを用いてペルオキシ型反応中間体を捕らえることに成功し、0-0結合の切断反応に及ぼすアミノ酸残基の役割を実証することに成功した。同じミオグロビンを用いて分担者の林らはヘムを非天然のポルフィセンに置換してたんぱく質分子の安定化ならびに本来の機能である酸素に対する親和性を大幅に増大させることに成功した。本成果は酵素機能のオーダーメイド化に補欠分子族であるヘムが重要な役割をもつことを示す。また藤井らは、ミオグロビンを改変して亜硝酸イオン還元酵素を創製する試みを行っており、本年度は補欠分子族としてジケト型イソバクテリオクロリンの合成に成功した。

研究成果

• [文献書誌] 市川 祐介: "P450camの分子表面残基Asp182 : Val-, Asn-, Leu-変異酵素の性質と結晶構造"生化学. 73. 874 (2001)
• [文献書誌] 下方 國稔: "ウシ/ヒトハイブリッドチトクロム酸化酵素の発現系の構築"生物物理. 41. S115 (2001)
• [文献書誌] Tomita, T.: "Elucidation of the differences between the 430- and 455-nm absorbing forms of P450-isocyanide adducts by resonance Raman spectroscopy"J.Biol.Chem.. 276. 36261 (2001)
• [文献書誌] Hitomi, Y.: "Interprotein Electron Transfer Reaction Regulated by an Artificial Interface"Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 40. 1098 (2001)
• [文献書誌] Hayashi, T.: "First Catalysis of Cobaltporphycenes : Oxidation of Vinyl Ether via Formation and Dissociation of Cobalt-Carbon Bond"Organometallics. 20. 3074 (2001)
• [文献書誌] Shimakoshi, H.: "Formation and Cleavage of a Dicobalt Complex Bridged with a Pentamethylene Group"Chem.Lett.. 346 (2001)
• [文献書誌] Dejima, H.: "New Myoglobin Reconstituted with an Iron Porphycene as a Structural Isomer of Heme Moiety"J.Inorg.Biochem.. 86. 200 (2001)
• [文献書誌] Ando, T.: "Photoinduced Electron Transfer within an Artificially Created Protein-Protein Complex"J.Inorg.Biochem.. 86. 124 (2001)
• [文献書誌] Hayashi, T.: "New Functionalization of Myoglobin by Chemical Modification of Heme-Propionates"Acc.Chem.Res.. 35. 35 (2001)
• [文献書誌] Hayashi, T.: "Chiral Recognition and chiral sensing by Use of Zinc Porphyprin Dimers"Tetrahedron. (in press). (2002)
• [文献書誌] Fujii, H.: "Electronic structure and reactivity of high-valent oxo iron porphyrins"Coor.Chem.Rev.. 226. 51 (2002)
• [文献書誌] Fujii, H.: "A Role for Highly Conserved Carboxylate, Aspartate-140, in Oxygen Activation and Heme Degradation by Heme Oxygenase-1"J.Am.Chem.Soc.. 123. 6475 (2001)
• [文献書誌] Hayashi, T.: "Chemical Properties of Reconstituted Myoglobins with Functionalized Hemin Derivatives"J.Inorg.Biochem.. 86. 57 (2001)