酵素法による非天然型の機能性DNAの合成とその応用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13132202
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 澤井 宏明 群馬大学, 工学部, 教授 (70012648)
• 研究分担者: 桑原 正靖 群馬大学, 工学部, 助手 (40334130) ; 尾崎 広明 群馬大学, 工学部, 助教授 (90211820)
• キーワード: 核酸 / DNA / 酵素反応 / 生体機能利用 / DNAポリメラーゼ / 分子認識 / 機能性DNA

研究概要

機能性基を導入した修飾DNAのPCR法による酵素的な合成が可能となれば、新しい機能性修飾DNAの創製、in vitro selectionによる修飾DNAアプタマー、修飾DNA触媒の創製への応用が可能になると考えられる。しかし、酵素、DNAポリメラーゼは基質特異性、鋳型特異性が厳密で、天然型のDNAの様に合成出来るとは限らない。本研究では、昨年度の研究成果をふまえ、こはく酸、イミダゾール、ピリジン、フェナントロリン、フルオレセイン、種々のアミノ酸などの機能性基をC5位に導入したチミヂン誘導体を合成した。さらにこれらを基質に用い、好熱性DNAポリメラーゼを用いたPCR法(DNAの重合連鎖反応)による機能性修飾DNAの合成の可能性の検討、さらに大量合成法の確立をはかった。このため、これらを基質として受け入れる事が出来る好熱性DNAポリメラーゼの探索を進めた。その結果、KOD Dash, Vent(exo-)など数種のDNAポリメラーゼを用いた時にのみ、対応する修飾DNAが合成できることを見出した。また、修飾チミジン3りん酸の5位に導入した置換基がアニオン性の場合、酵素の基質にならないものあるいは取り込み能が低くなることが判明した。この修飾DNAの合成反応を応用してフルオレセインを導入したチミヂン誘導体及びKOD Dash DNAポリメラーゼを用いたPCR反応でDNAプローブとしてDNA解析に有用な蛍光標識化DNAの合成を行った。さらにPCR法による修飾DNAの合成反応及び試験管内選択法を適用し、甘味剤アスパルテーム、最近薬剤として注目されているサリドマイドなどの特定の分子に結合する新規修飾DNAアプタマーの創製を行った。

研究成果

• [文献書誌] H.Sawai, A.Ozaki-Nakamura, M.Mine, H.Ozak: "Synthesis of new modified DNAs by hyperthermophilic DNA polymerase : Substrate and template specificity of functionalized thymidine analogues"Bioconjugate Chem.. 13. 309-317 (2002)
• [文献書誌] Y.Seto, K.Abe, M.Itoh, H.Sawai: "Preparation of conjugate of 2', 5'-triadenylate 5'-triphospahte and biotinylated firely luciferase and its use for sensitive bioluminescent enzyme immunoassay"Bioconjugate Chem.. 13. 303-308 (2002)
• [文献書誌] T.Ohbayashi, M.M.Masud, A.Ozaki-Nakamura, H.Ozaki, M.Kuwahara, H.Sawai: "Enzymatic synthesis of labelled DNA by PCR using new fluorescent thymidine nucleotide annlogue and superthermophilic KOD Dash DNA polymerase"Bioorg, Med. Chem. Lett.. 12. 1167-1170 (2002)
• [文献書誌] M.Matsukura, T.Okamoto, T.Miike, H.Sawai, K.Shinozuka: "Selective binding of trisamine-modified phosphorothioate antisense DNA to target mRNA improves antisense activity and reduces toxicity"Biochem. Biophys. Res. Commun., 293. 293. 1341-1347 (2002)
• [文献書誌] H.Saitoh, A.Nakamura, M.Kuwahara, H.Ozaki, H.Sawai: "Modified DNA aptamers against sweet agent aspartame"Nucleic Acids, Res. Suppl.. 2. 215-216 (2002)
• [文献書誌] M.Kuwahara, T.Ohbayashi, K.Hanawa, A.Shoji, A.N.Ozaki, H.Ozaki, H.Sawai: "Enzymatic Incorporation of Chemically-modified Nucleotides into DNAs"Nucleic Acids, Res. Suppl.. 2. 83-84 (2002)