人工制限酵素によるDNAの位置特異的切断と機能性核酸の合成

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13132204
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 小宮山 真 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (50133096)
• 研究分担者: 須磨岡 淳 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (10280934)
• キーワード: DNA / RNA / 人工制限酵素 / 加水分解 / 機能性核酸 / バイオテクノロジー / 遺伝子操作 / アクリジン

研究概要

今年度は、申請研究の初年度であるので、「人工制限酵素の構築」の方向性を確立し、その地歩固めをすることに主力を注いで研究を行なつた。また、アクリジン修飾DNA(機能性核酸)を用いたRNA切断についてもより詳細な検討を行った。
1.セリウム錯体/オリゴヌクレオチド型人工制限酵素の構造検討
従来は、オリゴヌクレオチドにEDTA系の配位子を一つだけ結合して、ここにセリウムを加えることで人工制限酵素を構築していた。しかし今回は、EDTA系配位子部位の数を種々変えて、その最適化を図った。その結果、複数の配位子部位をオリゴヌクレオチドに連続的に結合した方が、優れた選択的切断能を安定に発現することがわかった。
2.基質DNAの位置特異的活性化による選択的DNA切断
ターゲット部位であるリン酸ジエステル結合を選択的に活性化して選択的に切断する手法を追究した。このために、適切なオリゴヌクレオチドを用て、基質DNAの中にバルジならびにギャップ構造を作り、ここにセリウム/EDTAを加えた。その結果、バルジやギャップの位置で選択的切断が実現することを見出した。さらに、このような選択的DNA切断系に、オリゴアミンとインタカレータ(アクリジン)とのハイブリッド分子を添加すると、切断効率が飛躍的に高まるという興味ある結果を見出した。
3.種々のアクリジン修飾DNAによるRNAの塩基配列特異的切断
アクリジン部分の構造を変えた3種類の修飾オリゴヌクレオチドを合成し、そのRNA切断活性を評価した。その結果、アクリジン部分の窒素原子上の正の電荷が、RNAの位置選択的な活性化に極めて重要であることがわかった。さらに、アクリジン上の置換基も、RNA切断活性に顕著な影響を与を与えることが明らかになった。また、広範な金属イオンの触媒能を評価した結果、希土類イオン以外にも、亜鉛(II)イオン・マンガン(II)イオンが非常に活性が高いことがわかった。また、マグネシウム(II)イオンもRNA切断に有効であった。

研究成果

• [文献書誌] J.Sumaoka et al.: "Cooperation of the Ce(IV)/EDTA complex and oligoamine for prompt scission of DNA"Chem. Lett.. 20-21 (2001)
• [文献書誌] A.Kuzuya et al.: "New ribozyme-mimics employing Mg(II) ion as catalytic center"Chem. Lett.. 584-585 (2001)
• [文献書誌] K.Matsumura et al.: "Trinuclear Cu(II) complex for internucleoside linkage-specific cleavage of RNA"Nucleic Acids Res. Supple. 1. 85-86 (2001)
• [文献書誌] A.Kuzuya et al.: "Site-selective artificial ribonuclease using pinpoint RNA activation"Nucleic Acids Res. Supple. 1. 131-132 (2001)
• [文献書誌] M.Komiyama et al.: "Sequence -Selective Artificial Ribonucleases"Methods in Enzymology, Ribonucleases Part 1. 341. 455-468 (2001)
• [文献書誌] 小宮山 真: "化学が作る次世代のバイオテクノロジー"未来材料. 2. 10-11 (2002)
• [文献書誌] H.Asanuma et al.: "Photocontrol of DNA-duplex formation by using azobenzene-bearing oligonucleotides"Chem. Biochem.. 2. 39-44 (2001)
• [文献書誌] H.Asanuma et al.: "Spiropyran as a regulator of DNA hybridization with reversed switching mode to that of azobenzene"Chem. Lett.. 108-109 (2001)
• [文献書誌] T.Takarada et al.: "L-Threoninol as a chiral linker of azobenzene for the effective photo-regulation of DNA triplex formation"Chem. Lett.. 732-733 (2001)
• [文献書誌] H.Asanuma et al.: "Enantioselective incorporation of azobenzenes into oligodeoxyribonucleotide for the effective photo-regulation of duplex formation"Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 40(14). 2671-2673 (2001)
• [文献書誌] X.Liang et al.: "Phenylazonaphthalene as a superb photo-regulator for DNA-triplex formation"Tetrahedron. Lett.. 42. 6723-6725 (2001)
• [文献書誌] X.Liang et al.: "Photo-regulation of DNA triplex formation by azobenzene"J. Am. Chem. Soc. 124. 1877-1883 (2001)
• [文献書誌] H.Asanuma et al.: "Photo-regulation of RNA polymerase reaction by use of modified DNA carrying an azobenzene"Nucleic Acids Res. Supple.. 1. 55-56 (2001)
• [文献書誌] H.Asanuma et al.: "Regulation of aggregated structure of dye molecules by DNA hybridization"Nucleic Acids Res. Supple.. 1. 193-194 (2001)
• [文献書誌] H.Asanuma et al.: "H-aggregation of Methyl Reds by the hybridization of DNA-dye conjugates"Chem. Lett.. 1. 85-86 (2001)
• [文献書誌] A.Kuzuya et al.: "Conjugation of various acridines to DNA for site-selective RNA scission by lanthanide ion"Bioconjugate Chem.. (印刷中).
• [文献書誌] M.Komiyama et al.: "Cutting DNA and RNA""Handbook on the Physics and Chemistry of Rare Earths". 35(印刷中).
• [文献書誌] 須磨岡 淳 他: "「化学フロンテイア:生命化学のニューセントラルドグマ」 第4章 遺伝子切断"化学同人. 275 (2002)
• [文献書誌] 小宮山 真 他: "「化学便覧応用編」「バイオインスパイアードケミストリー」"丸善(印刷中).
• [文献書誌] M.Komiyama et al.: "Sequence-selective scission of DNA and RNA by lanthanide ions and their complexes in "Metal Ions in Biological Systems""Marcel Dekker(印刷中).