2002 年度実績報告書

人工制限酵素によるDNAの位置特異的切断と機能性核酸の合成

研究課題

研究課題/領域番号	13132204
研究機関	東京大学
研究代表者	小宮山真東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (50133096)
研究分担者	須磨岡淳東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (10280934) 浅沼浩之東京大学, 先端科学技術研究センター, 助教授 (20282577)
キーワード	DNA / 制限酵素 / リン酸エステル / アクリジン / セリウム / PNA / 加水分解 / RNA
研究概要	昨年度に確立した人工制限酵素の構築の方向性をもとに,より高活性な人工制限酵素を開発することに主力を注いで研究をおこなった. 1.セリウム-オリゴヌクレオチド型人工制限酵素エチレンジアミン三酢酸を結合した非天然型ヌクレオチド(X)を導入したオリゴヌクレオチドを合成し,そこにセリウム-EDTAを加えることで人工制限酵素の構築を試みた.その結果,Xの導入とギャップ構造による基質の活性化がDNAの塩基配列特異的切断に必須であることが明らかになった.また,ギャップの両端にXを導入することで活性は比較的に向上した. 2.種々のアクリジン修飾DNAのよるRNAの塩基配列特異的切断様々な置換基を持つアクリジン修飾を合成し,RNAの活性可能のさらなる向上を追求した.その結果,9-アミノ-2-メトキシ-6-ニトロアクリジン修飾DNAが従来のアクリジン修飾DNAの約2倍の活性化能を持つことが明らかになった. 3.RNAを選択的に二箇所切断する人工リボヌクレアーゼ(RNAカッター)の構築一本のオリゴヌクレオチド鎖中に二個導入されたアクリジンは互いに阻害することなく高選択的・効率的に基質RNAを活性化することを明らかにした. 4.PNAとヌクレアーゼS1の併用によるDNAの選択的切断種々の基質DNAとPNAに二重鎖を形成させ,これをヌクレアーゼS1で処理した.その結果,DNAとPNAが完全に相補的である場合にのみ酵素分解の後にもDNA/PNA二重鎖が分解されず系中に存在することが明らかになった.一方,ミスマッチを含む二重鎖の場合にはDNAはほぼ完全にモノマーにまで分解された.PNAの使用は必須であり,同じ配列のDNAを用いた場合は完全な二重鎖の場合でもモノマーまで分解された.反応初期段階の追跡から,ミスマッチ部位へヌクレアーゼが直接作用し切断する機構の存在が強く示唆された.

研究成果
(14件)

すべてその他

すべて文献書誌 (14件)

[文献書誌] A.Kuzuya et al.: "Metal ion-induced site-selective RNA hydrolysis by use of acridine-bearing oligonucleotide as cofactor"J.Am.Chem.Soc. 124. 6887-6894 (2002)
[文献書誌] Y.Kitamura et al.: "Preferential hydrolysis of gap and bulge sites in DNA by Ce(IV)/EDTA complex"Nucleic Acids Res.. 30. e102 (2002)
[文献書誌] M.Yashiro et al.: "Effect of alkaline earth metal ions on the phosphodiester hydrolysis of RNA"Bull.Chem.Soc.Jpn.. 75. 1843-1844 (2002)
[文献書誌] M.Komiyama et al.: "Trinuclear copper(II) complex showing high selectivity for the hydrolysis of 2'-5' over 3'-5' for Up U and 3'-5' over 2'-5' for ApA ribonucleotides"J.Am.Chem.Soc.. 124. 13731-13736 (2002)
[文献書誌] A.Kuzuya et al.: "A highly acidic acridine for efficient site-selective activation of RNA leading to an eminent ribozyme mimic"Tetrahedron Lett.. 43. 8249-8252 (2002)
[文献書誌] A.Kuzuya et al.: "Novel approach for SNP genotyping based on site-selective RNA scission"Nucleic Acids Res.Supple.. 2. 129-130 (2002)
[文献書誌] M.Komiyama et al.: "Site-selective activation of RNA leading to sequence-selective RNA cutters"Bull.Chem.Soc.Jpn.. 75. 2547-2554 (2002)
[文献書誌] S.Ye et al.: "DNA protection by PNA from enzymatic digestion for mass-spectroscopic genotyping"Chem.Lett.. 32. 10-11 (2003)
[文献書誌] X.Liang et al.: "Photo-regulation of DNA triplex formation by azobenzene"J.Am.Chem.Soc.. 124. 1877-1883 (2002)
[文献書誌] H.Asanuma et al.: "H-aggregation of Methyl Reds by the hybridization of DNA-dye conjugates"Chem.Lett.. 490-491 (2002)
[文献書誌] H.Asanuma et al.: "Photoregulation of the transcription reaction of T7 RNA polymerase by tethering an azobenzene to the promoter"Chem.BioChem. 3. 786-789 (2002)
[文献書誌] H.Asanuma et al.: "Photo-regulation of transcription by RNA polymerase with azobenzene-tethered promoter"Nucleic Acids Res.Supple.. 2. 75-76 (2002)
[文献書誌] 小宮山真: "化学が作る次世代のバイオテクノロジー"未来材料. 2. 10-11 (2002)
[文献書誌] 小宮山真: "核酸の材料素材としての活用"化学. 57. 23-24 (2002)

2002 年度 実績報告書

人工制限酵素によるDNAの位置特異的切断と機能性核酸の合成

研究代表者

小宮山 真 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (50133096)

研究成果

[文献書誌] A.Kuzuya et al.: "Metal ion-induced site-selective RNA hydrolysis by use of acridine-bearing oligonucleotide as cofactor"J.Am.Chem.Soc. 124. 6887-6894 (2002)

[文献書誌] Y.Kitamura et al.: "Preferential hydrolysis of gap and bulge sites in DNA by Ce(IV)/EDTA complex"Nucleic Acids Res.. 30. e102 (2002)

[文献書誌] M.Yashiro et al.: "Effect of alkaline earth metal ions on the phosphodiester hydrolysis of RNA"Bull.Chem.Soc.Jpn.. 75. 1843-1844 (2002)

[文献書誌] M.Komiyama et al.: "Trinuclear copper(II) complex showing high selectivity for the hydrolysis of 2'-5' over 3'-5' for Up U and 3'-5' over 2'-5' for ApA ribonucleotides"J.Am.Chem.Soc.. 124. 13731-13736 (2002)

[文献書誌] A.Kuzuya et al.: "A highly acidic acridine for efficient site-selective activation of RNA leading to an eminent ribozyme mimic"Tetrahedron Lett.. 43. 8249-8252 (2002)

[文献書誌] A.Kuzuya et al.: "Novel approach for SNP genotyping based on site-selective RNA scission"Nucleic Acids Res.Supple.. 2. 129-130 (2002)

[文献書誌] M.Komiyama et al.: "Site-selective activation of RNA leading to sequence-selective RNA cutters"Bull.Chem.Soc.Jpn.. 75. 2547-2554 (2002)

[文献書誌] S.Ye et al.: "DNA protection by PNA from enzymatic digestion for mass-spectroscopic genotyping"Chem.Lett.. 32. 10-11 (2003)

[文献書誌] X.Liang et al.: "Photo-regulation of DNA triplex formation by azobenzene"J.Am.Chem.Soc.. 124. 1877-1883 (2002)

[文献書誌] H.Asanuma et al.: "H-aggregation of Methyl Reds by the hybridization of DNA-dye conjugates"Chem.Lett.. 490-491 (2002)

[文献書誌] H.Asanuma et al.: "Photoregulation of the transcription reaction of T7 RNA polymerase by tethering an azobenzene to the promoter"Chem.BioChem. 3. 786-789 (2002)

[文献書誌] H.Asanuma et al.: "Photo-regulation of transcription by RNA polymerase with azobenzene-tethered promoter"Nucleic Acids Res.Supple.. 2. 75-76 (2002)

[文献書誌] 小宮山 真: "化学が作る次世代のバイオテクノロジー"未来材料. 2. 10-11 (2002)

[文献書誌] 小宮山 真: "核酸の材料素材としての活用"化学. 57. 23-24 (2002)

2002 年度実績報告書

小宮山真東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (50133096)

[文献書誌] 小宮山真: "化学が作る次世代のバイオテクノロジー"未来材料. 2. 10-11 (2002)

[文献書誌] 小宮山真: "核酸の材料素材としての活用"化学. 57. 23-24 (2002)