動物体細胞を使った逆遺伝学によるDNA組み換え、修復、複製の系統的解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13141202
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 園田 英一朗 京都大学, 医学研究科, 助教授 (50281093)
• 研究分担者: 大森 治夫 京都大学, ウイルス研究所, 教授 (10127061) ; 榎本 武美 東北大学, 薬学研究科, 教授 (80107383)
• キーワード: 相同組換え / 複製後修復 / DT40 / DNA修復 / Rev3 / Werner症候群 / DNAポリメラーゼ

研究概要

生体内では、種々の内的および外的要因によりたえず塩基レベルのDNA損傷が大量に発生する。未修復のまま残った損傷に複製フォークが遭遇すると、複製が停止しうる。DNA複製が完了できないと、その後のM期での染色体の凝縮と分配が正常に起こらないので、細胞にとって致死である。複製が停止した場合におこるトラブルは、複製後修復経路によってプロセスされ、複製が再開される。酵母のミュータントの解析から、主要な複製後修復には、(A)損傷乗り越えDNA合成(Translesion DNA synthesis = TLS)と(B)相同DNA組換え(Homologous DNA recmbination = HR、複製が停止した姉妹染色分体が複製を継続している姉妹染色分体と組み換えすることによって複製停止から回復)とがあることがわかっている。(A)TLSに関与すると考えられるDNAポリメラーゼ(TLS DNAポリメラーゼ)のヒトホモログ遺伝子が最近4年間に8種類も見つかった。高等真核細胞における複製後修復の役割は、これらに関与する遺伝子の多くがその欠損によりマウスで胎生致死になるので、よくわかっていない。
我々は、動物細胞で唯一標的組み換えがランダムインテグレイションと同効率で起るニワトリBリンパ細胞株DT40を使って、(A)TLSと(B)HRの欠損株を系統的に作製、解析してきた。そして、HRとTLSは、互いにオーバーラップしながら、大量に発生している複製ブロックから回復するのに必須の働きをすることを解明した。このように恒常的に機能しているHRによる修復反応は、姉妹染色分体交換として検出できることを我々は明らかにした。自然発生する姉妹染色分体交換のレベルと標的組み換え効率とは、正に相関することから、我々は、恒常的に機能しているHRによる修復反応が標的組み換えにも同時に関与すると仮定して研究を進めている。(担当:園田)
Werner症候群原因遺伝子産物(WRN)と結合するWHIPの機能の解析を行い、WHIPが多量体を形成してWRNと結合すること、両者の結合にはATPが必要であるが、ATPを要求するのはWHIPであることを明らかにした。また、酵母を用いた解析により、WHIPのRFCに似たモチーフがWHIPの機能の発現に必須であること、WHIPはDNAポリメラーゼdと結合し、DNAポリメラーゼdと機能的関連をもつことがわかった。(担当:榎本)
ベンゾピレンは生体内で活性化されて、主にDNAのグアニンのN2の位置に付加体を形成する。ヒトPolkはin vitroにおいてそのような損傷の向側にシトシンを挿入して比較的効率良くバイパスすることを明らかにした。マウスのES細胞においてその酵素をコードする遺伝子の欠損変異株を分離したところ、in vitroの結果と一致してベンゾピレンに対して感受性となることが分かった。免疫グロブリン遺伝子は抗原との親和性を増すために可変領域の一部において突然変異が高頻度に起こること(somatic hypermutation)が知られているが、Polk欠損マウスにおいてもそのような現象はほぼ正常に起こっていることが分かった。(担当:大森)

研究成果

• [文献書誌] Morrison, C., Vagnarelli, P., Sonoda, E., Takeda, S., Earnshaw, W.C.: "Sister chromatid cohesion and genome stability in vertebrate cells"Biochem Soc Trans. 31. 263-265 (2003)
• [文献書誌] Yang, I-Y., Miller, H., Wang, Z., Frank, E.Z, Ohmori, H., Hanaoka, F., Moriya, M.: "Mammalian translesion DNA synthesis across an acrolein-derived deoxyguanosine adduct: Participation of pol kappa in error-prone synthesis in human cells"J.Biol.Chem.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Shimizu, T., Shinkai, Y., Ogi, T., Ohmori, H., Azuma, T.: "The absence of DNA polymerase kappa does not affect somatic hypermutation of the mouse immunoglobulin heavy chain gene"Immunology Letters. (in press). (2003)
• [文献書誌] Wang, W., Seki, M., Narita, Y., Nakagawa, T., Yoshimura, A., Otsuki, M., Yoh-ichi Kawabe, Y., Tada, S., Yagi, H., Ishi, Y., Enomoto, T.: "Functional relation among RecQ family helicases, RecQL1, RecQL5, and BLM in cell growth and SCE formation"Mol.Cell.Biol.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Odagiri, N., Seki, M., Onoda, F., Yoshimura, A., Watanabe, S., Enomoto, T.: "Budding yeast mms4 is epistatic with rad52 and its function can be replaced by a bacterial Holliday junction resolvase"DNA Repair. 2. 347-358 (2003)
• [文献書誌] Yamashita, Y.M., Okada, T., Matsusaka, T., Sonoda, E., Zhao, G.Y., Araki, K., Tateishi, S., Yamazumi, M., Takeda, S.: "RAD18 and RAD54 cooperatively contribute to maintenance of genomic stability in vertebrate cells"EMBO J. 21. 5558-5566 (2002)
• [文献書誌] Tauchi, H., Kabayashi, J,.Morishima, K., van Gent, D.C., Shiraishi, I., Verkaik, A., Sonoda, E., Takata, M., Takeda, S., Matsuura, S., Komatsu, K.: "Nbs1 is essential for DNA repair by homologous recombination in higher vertebrate cells"Nature. 420. 93-98 (2002)
• [文献書誌] Okada, T., Sonoda, E., Yamashita, Y.M., Koyoshi, S., Tateishi, S,.Yamaizumi, M., Takata, M., Ogawa, O., Takeda, S.: "Involvement of vertebrate polkappa in Rad18-independent postreplication repair of UV damage"J Biol Chem. 277. 48690-48695 (2002)
• [文献書誌] Onodera, R., Seki, M., Ui, A., Satoh, Y., Miyajima, A., Onoda, F., Enomoto, T.: "Functional and physical interaction between Sgs1 and Top3 and Sgs1-independent function of Top3 in DNA recombination repair"Genes Genet.Syst.. 77. 11-21 (2002)
• [文献書誌] Kobayashi, T., Tada S., Tsuyama, T., Murofushi, H., Seki, M., Enomoto.T.: "Focus-formation of replication protein A, activation of checkpoint system and DNA repair synthesis induced by DNA double-strand breaks in Xenopus egg extract"J.Cell Sc. 115. 3159-3169 (2002)
• [文献書誌] Branzei, D., Seki, M., Onoda, F., Yagi, H., Kawabe, Y.-i., Enomoto, T.: "Characterization of the slow-growth phenotype of S. cerevisiae whip/mgs1 sgs1 double deletion mutants"DNA Repair. 1. 671-682 (2002)
• [文献書誌] Hayashi, T., Seki, M., Maeda, D., Wang, W., Kawabe, Y.-i., Seki, T., Fukagawa, T., Yagi, H., Enomoto, T.: "Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells"Exp. Cell Res.. 280. 212-221 (2002)
• [文献書誌] Branzei, D., Seki, M., Onoda, F., Enomoto, T.: "Saccharomyces cerevisiae WHIP/MGS1 gene interacts genetically with DNA replication genes"Mol.Gen.Genet.. 268. 371-368 (2002)
• [文献書誌] Suzuki, N., Ohashi, E., Kolbanovskiy, A., Geacintov, N.E., Grollman, A.P., Ohmori, H., Shibutani, S.: "Translesion synthesis by human DNA polymerase kappa on a DNA template containing a single stereoisomer of dG-(+)-or dG-(-)-anti-N2-BPDE (7,8-dihydroxy-anti-9,10-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyrene)"Biochemistry. 41. 6100-6106 (2002)
• [文献書誌] Ogi, T., Shinkai, Y., Tanaka, K., Ohmori, H.: "Pol kappa protects mammalian cells against the lethal and mutagenic effects of benzo[a]pyrene"Proc.Natl.Acad, Sci, USA. 99. 15548-15553 (2002)
• [文献書誌] Frank, E.G., Sayer, J.M., Kroth, H., Ohashi, E., Ohmori, H., Jerina, D.M., Woodgate, R.: "Translesion replication of benzo[a]pyrene and benzo[c]phenanthrene diol epoxide adducts of deoxyadenosine and deoxyguanosine by human DNA polymerase kappa"Nucleic Acids Res.. 30. 5284-5292 (2002)