フォト・パニング法による受容体タンパク質の機能解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13202023
• 研究機関: 富山医科薬科大学
• 研究代表者: 定金 豊 富山医科薬科大学, 薬学部, 助手 (60293304)
• 研究分担者: 畑中 保丸 富山医科薬科大学, 薬学部, 教授 (30111181)
• キーワード: 光アフィニティーラベル / ジアジリン / ハイスループット / 糖鎖結合タンパク質 / ペプチド結合タンパク質 / DNA結合タンパク質 / プロテオーム解析 / 不斉合成

研究概要

【研究の目的】フォト・パニング法は、我々が独自に提唱するまったく新しいクローニング法であり、この方法の開発と有用性の実証が達成目標である。光反応基ジアジリンから生じる高反応種カルベンが相手分子と共有結合するという性質を利用したフォト・パニング法は、(1)従来のパニング法に比べて高速で簡便な解析が可能、(2)固相上のパニング素子で多種のリガンドの同時解析が可能、(3)光反応基「ジアジリン」の特性による選択性の向上、などの特徴を持つ。共有結合の有無で選択するというデジタル的選別法であるフォト・パニング法は、新しいプロテオーム解析法として期待できる。
【研究の成果】
1.固相集積型・光アフィニティー・パニング素子の開発
(1)3種類の固相集積型・パニング素子プラットフォームを設計、それら合成法を確立した。
(2)糖鎖、およびペプチドをリガンドとする、固相集積型パニング素子の開発に成功した。
(3)新しい光反応性ペプチドリガンド製作のための、光反応性フェニルアラニン誘導体の小規模・不斉合成法を確立した。
(4)DNAの特定部位にジアジリン型・光アフィニティー・プローブを搭載する方法を確立した。
2.受容体提示発現系の開発
(5)研究期間が短縮されたため、大腸菌での発現系の開発は見送り、バクテリオファージタンパク質発現系を利用したフォト・パニング法の確立に注力した。
(6)特定のタンパク質を発現したファージが、糖鎖およびペプチドをリガンドとする固相集積型パニング素子で、効率的に選択・捕獲されることを確認した。
【まとめ】ジアジリン型・光アフィニティー・ラベルを搭載できるリガンドが、糖鎖、ペプチド、DNAへと拡がり、それらと結合するタンパク質を効率的にクローニングする方法の基礎が出来上がった。バクテリオファージタンパク質発現系を利用し、フォト・パニング法の基礎的なノウハウを蓄積した。

研究成果

• [文献書誌] Hatanaka, Y., Sadakane, Y: "Photoaffinity Labeling in Drug Discovery and Developments : Chemical Gateway for Entering Proteomic Frontier"Current Topics in Medicinal Chemistry. 2(3). 271-288 (2002)
• [文献書誌] Sadakane Y, Nakashima H., Park JJ, Nakagomi K., Hatanaka Y.: "EFFICIENT CLONING OF CARBOHYDRATE BINDING PROTEINS"Photomedicine and Photobiology. 22(in press). (2002)
• [文献書誌] M.Hashimoto, Y.Hatanaka, K.Nabeta: "Versatile synthesis of phenoxydiazirine based fatty acid analogues and photoreactive galactosylceramide"Bioorg.Med.Chem.Lett. 12. 89-91 (2002)
• [文献書誌] M.Hashimoto, Y.Hatanaka, J.Yang, J.Dhesi, G.D.Holman: "Synthesis of Biotinylated Bis(D-Glucose)Derivatives for Glucose Transporter Photoaffinity Labelling"Carbohydr.Res.. 331. 119-127 (2001)
• [文献書誌] Y.Hatanaka, M.Ishiguro, M.Hashimoto, L.N.Gastinel, K.Nakagomi: "A Model of Photoprobe Docking with b1,4-Galactosyltransferase Identify a Possible Carboxylate Involved in Glycosylation Steps"Bioorg.Med.Chem.Left.. 11. 411-413 (2001)