廃棄物埋立地でのメタン生成と酸化に関与する微生物生態の分子半物学的手法による解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13450214
• 研究機関: 長岡技術科学大学
• 研究代表者: 原田 秀樹 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (70134971)
• 研究分担者: 荒木 信夫 長岡工業高等専門学校, 環境都市工学科, 助教授 (30193072) ; 大橋 晶良 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (70169035)
• キーワード: 廃棄物埋立地 / 16SrRNA / 温暖化効果ガス / FISH法 / メタン生成古細菌 / メタン酸化細菌 / 分子系統解析 / クローン解析

研究概要

廃棄物埋め立て土壌の深さ100cm部分からDNAを抽出し、古細菌由来の16SrDNAのみをPCR増幅してクローニングを行い、ランダムに72クローンを選択した。この72個のクローンはRFLP解析により6種類の電気泳動パターンに分類できた。この6種類のクローンの塩基配列を決定し、分子系統解析を行った結果、6クローン全てが既知のメタン生成古細菌に近縁であることが判明した。しかし、それらクローンの塩基配列は、既知のメタン生成古細菌の配列と100%の相同性を示すものは存在しなかった。この結果から、本研究で用いた廃棄物埋立土壌中に新規のメタン生成古細菌が存在する可能性が示唆された。また、この分子系統解析から、各クローンの基質資化性を推察すると、おそらく土壌中のメタン生成古細菌は水素資化性のものが酢酸資化性のものよりも優占的に存在している可能性がある。この結果は、先のメタン生成活性試験の結果と一致していた。次に、FISH法による廃棄物土壌中の微生物の定量により土壌深さ100cmおよび300cmにおいてメタン生成古細菌が検出された。しかし、検出率としてはEtBr染色によって検出された全菌数のうちの0.01%と非常に少なく、FISH法での正確な定量は困難であった。また、メタン酸化細菌はどのサンプルにおいても検出されなかった。この結果を活性試験の結果と併せて考えると、これらの微生物は土壌中に確かに存在するが、活性が低いと考えられる。従って、土壌に存在する微生物は実際の環境中でその活性が低いことから、DNAプローブの標的となる16SrRNA含量が低いためにFISH法による検出は困難であったと考えられる。これらの結果から、in situで目的微生物を検出するためには、さらに高感度のFISH法などの新しいアプローチが必要であると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] 多川正, 関口勇地, 荒木信夫, 大橋晶良, 原田秀樹: "UASB廃水処理プロセスでの嫌気性微生物群集の分子生物学的手法による動態解析"環境工学研究論文集. 38. 151-162 (2001)
• [文献書誌] Y.Sekiguchi, H.Takahashi, Y.Kamagata, A.Ohashi, H.Harada: "In situ Detection, IsoIation and Physiological Properties of a Thin Filamentous Microoganism Abundant in Methanogenic Granular Sludges : a Novel Isolate affiliated with a Clone Cluster, the Green Non Sulfur Bacteria Subdivision 1"Applied and Environmental Microbiology. 67. 5740-5749 (2001)
• [文献書誌] Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, H.Harada: "Recent Advances in Methane Fermentation Technology"Current Opinion in Biotechnology. Vol.12 No.3. 277-282 (2001)
• [文献書誌] Yamaguchi T., Uemura S., I-Cheng Tseng, Ohashi A., Harada H.: "Microbial-Ecological Significance of Sulfide Precipitation within Anaerobic Granular Sludge Reveled by Micro-electrodes Study"Water Research. Vol.35 No.14. 3411-3417 (2001)
• [文献書誌] Shutsubo K., Sinthurat N., Ohashi A., Harada H.: "Population Dynamics of Anaerobic Microbial Consortia in Thermophilic Granular Sludge in Response to Feed Composition Change"Water Science and Technology. Vol.43 No.1. 59-66 (2001)