ファージセラピーを目指した感染動力学に関する研究

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13450340
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 丹治 保典 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教授 (00282848)
• 研究分担者: 宮永 一彦 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (40323810) ; 堀 克敏 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (50302956) ; 海野 肇 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 教授 (10087471)
• キーワード: ファージ / 大腸菌O157:H7 / レセプター / ファージセラピー / 緑色蛍光タンパク / 病原性大腸菌 / 宿主認識 / 蛍光検出

研究概要

健康なブタ糞便からスクリーニングされた大腸菌O157:H7特異的ファージをPP01と命名し、PP01の宿主認識機構を解析した。大腸菌O157:H7のOmpC遺伝子をプラスミドにクローニングし、耐性菌をそのプラスミドで形質転換すると、PP01に対する被感染性が回復した。さらにOmpC欠損大腸菌K12(W3110)を同プラスミドで形質転換すると、PP01に対し被感染性を示した。これらの事実より、大腸菌O157:H7のOmpCがPP01ファージのレセプターとして機能していることが分った。また、ファージのテールファイバー先端に位置するgp38タンパク質がOmpCを認識することが分った。大腸菌O157:H7と大腸菌K12(W3110)のOmpCを比較するとアミノ酸配列で97%の相同性を示す。gp38はこの僅かなアミノ酸配列の違いを識別できる分子センサーといえる。
PP01ファージ単独では大腸菌O157:H7を抑制することが出来なかった。そこで複数のファージを用いることで、大腸菌O157:H7のコントロールを試みた。一種のファージと宿主とを長時間培養すると、ファージ耐性菌の出現が見られる。宿主のファージに対する耐性機構はファージによって異なる。ファージを複数混合すると、両ファージに対して宿主が耐性能を獲得する必要があるため、耐性菌が出現するまでの時間が延長された。
PP01ファージは大腸菌O157:H7に対し特異的感染性を示した。そこで、PP01ファージの頭殻に緑色蛍光蛋白質を発現することにより、蛍光標識PP01を分子構築した。蛍光標識ファージは野生株と同様に大腸菌O157:H7に特異的に吸着し、紫外線を照射することにより、被吸着大腸菌O157:H7を緑色に可視化することが出来た。また、蛍光標識ファージは、生きてはいるが培養できない状態(VBNC)の細胞に対しても吸着することが出来、培養法では検出が困難とされたVBNC状態の大腸菌O157:H7を数十分以内で検出することを可能とした。

研究成果

• [文献書誌] Y.Tanji, K.Mizoguchi, M.Yoichi, M.Morita, N.Kijima, H.Kato, H.Unno: "Seasonal change and fate of coliphages infected to Escherichia coli O157:H7 in a wastewater treatment plant"Water Research. 37. 1136-1142 (2003)
• [文献書誌] K.Mizoguchi, M.Morita, C.R.Fischer, M.Yoichi, Y.Tanji, H.Unno: "The coevolution of PP01 phage and Escherichia coli O157:H7 in continuous culture"Apple.Env.Microbiol. 69. 170-176 (2003)
• [文献書誌] M.Oda, M.Morita, H.Unno, Y.Tanji: "Rapid Detection of Escherichia coli O157:H7 using GFP-labeled PP01 Bacteriophage"Apple.Env.Microbiol. 70. 527-534 (2004)
• [文献書誌] Y.Tanji, T.Shimada, M.Yoichi, K.Miyanaga, K.Hori, H.Unno: "Toward rational control of Escherichia coli O157:H7 by a phage cocktail"Appl.Microbiol.Biotechnol.. (in press).
• [文献書誌] Y.Orito, M.Morita, K.Hori, H.Unno, Y.Tanji: "Bacillus amyloliquefaciens phage endolysin can enhance permeability of Pseudomonas aeruginosa outer membrane and induce cell lysis"Appl.Microbiol.Biotechnol.. (in press).
• [文献書誌] M.Yoichi, M.Morita, K.Mizoguchi, C.R.Fischer, H.Unno, Y.Tanji: "The criterion for selecting effective phage for Escherichia coli O157:H7 control"J.Biochem.Eng. (in press).