| 研究課題/領域番号 |
13460037
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
関口 順一 国立大学法人信州大学, 繊維学部, 教授 (80111053)
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| 研究分担者 |
佐藤 勉 東京農工大学, 農学研究科, 助教授 (70215812)
山本 博規 国立大学法人信州大学, 繊維学部, 助手 (20262701)
志田 敏夫 国立大学法人信州大学, 繊維学部, 助教授 (40162599)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| キーワード | 枯草菌 / 表層蛋白 / 多糖デアセチラーゼ / 細胞分離 / 細胞壁溶解酵素 / FLAG蛋白 |
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| 研究概要 |
細胞表層における合成・修飾機構を解明するため、枯草菌の多糖デアセチラーゼのホモログであるybaN(pdaB)の機能を検討した。この遺伝子破壊株を構築し、位相差顕微鏡で調べた結果、胞子形成の初期から中期にかけては野生株と同様の形態を示すのに対し、胞子形成後期になると、darkのタイプの胞子が増加して、24時間の培養後では約90%の胞子がdarkのタイプになった。遺伝子発現制御を調べてみると、シグマE-RNA合成酵素で転写される遺伝子であった。さらに48時間培養のdarkの胞子を電子顕微鏡で観察すると、胞子内部が完全に無くなったタイプ、一部のみが見られるタイプ、野生型に近いタイプなど、ヘテロの集団の胞子であることが解った。このdarkの胞子は完全に増殖能力を失っていた。これらの結果は枯草菌の多糖デアセチラーゼホモログの1つPdaAがコルテックスの成熟に関与するのに対し、これと異なる機能を示すことが解った。
一方栄養増殖時期の細胞壁と、そこに結合する細胞壁溶解酵素の局在部位の解析法を開発した。目的遺伝子の3'-末端とアスパラギン酸を多く含むFLAGペプチド遺伝子を翻訳融合し、枯草菌に導入して染色体DNAと組換えさせ、目的遺伝子の転写に依存して発現させた。タンパク質の局在場所は、FLAGに対する1次抗体と、その抗体に対する抗体(FITCを結合させた2次抗体)により可視化し、蛍光顕微鏡で観察する方法を用いた。本方法により3種の細胞壁溶解酵素の局在場所を決定し、そのうちLytE,LytFの2つが細胞分裂・分離部位に局在していた。本結果より、細胞壁も均一な成分ではなく、細胞分裂・分離部位にはことなる細胞壁の構造(組成)からなることを明らかにした。本研究成果は細胞分裂・分離の機構の解明に役立つとともに、細胞表層タンパク質全般の機能解明に役立つものである。
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