| 研究課題/領域番号 |
13460049
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
坂田 完三 京都大学, 化学研究所, 教授 (20087563)
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| 研究分担者 |
清水 文一 京都大学, 化学研究所, 助手 (50324695)
水谷 正治 京都大学, 化学研究所, 助手 (60303898)
平竹 潤 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80199075)
加藤 博章 理化学研究所, 播磨研究所, チームリーダー (90204487)
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| キーワード | 二糖配糖体 / ジグリコシダーゼ / 二糖配糖体加水分解酵素 / β-プリメベロシダーゼ / グリコシダーゼファミリー / コンビナトリアル / アフィニティー吸着体 / 基質特異性 |
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| 研究概要 |
本研究では、植物界に"新しい二糖配糖体特異的グリコシダーゼファミリー"が存在することを明らかにし、植物におけるこれら二糖配糖体特異的グリコシダーゼの本来の機能解明を目指し、下記の研究を行った。
(A)二糖配糖体特異的グリコシダーゼの触媒機能の解明
1)コンビナトリアル的手法による基質特異性の解析:アグリコン部分を2-phenylethanolに固定し、種々の二糖配糖体のグリコンライブラリーを得てプリメベロシダーゼの基質特異性を調べた。本酵素は、1→6結合を有する二糖配糖体のみを二糖とアグリコンに加水分解し、特にβ-プリメベロシドに対し高い基質特異性を示すことが明らかとなった。
アグリコン部分の特異性解明のためのコンビナトリアル的手法を確立するため、β-グルコシダーゼをモデルに、先ず7種のβ-D-グルコピラノシドを合成し、GC-MSを用いた手法を試みたところ、新しいグリコシダーゼの基質特異性による分類ができる手懸かりを得つつある。
2)特異的阻害剤の合成:我々は最近、新規グリコシルアミジン誘導体が各種糖に対して高い選択性で極めて強力な阻害活性を示すことを見いだし、これを利用してβ-グルコシダーゼのアフィニティー吸着体を調製した。この吸着体はチャ葉プリメベロシダーゼの精製の際のCM-Toyopearlからの溶出時に重なって溶出されてきていたβ-グルコシダーゼを選択的に吸着することが明らかとなり、これを用いることで、プリメベロシダーゼの精製が格段に効率化でき、チャ葉からのプリメベロシダーゼの大量調製に応用できることが判った。
3)プリメベロシダーゼの大量発現系の構築:糖鎖修飾が可能なバキュロウイルス昆虫細胞発現系により全長cDNAを発現させた。組み換え酵素は比活性が高く安定で、糖鎖修飾を受け細胞外へ分泌された。静置フラスコによる小規模培養では、1L培養当たり2mg程度の発現が見られ、発現条件を検討することにより結晶化に必要となる酵素量を発現精製することが期待できる。
(B)植物における"新しい二糖配糖体特異的グリコシダーゼファミリー"の確立
1)プリメベロシダーゼ抗体の調製と同酵素の存在の確認:チャ樹由来プリメベロシダーゼcDNAを用いてプリメベロシダーゼのHis-tag融合タンパク質を大腸菌で発現させた。不活性な封入体として発現した発現タンパク質を6Mグアニジン塩酸で変性可溶化した後、Ni-NTAアフィニティーカラムで精製した。これを抗原として抗プリメベロシダーゼ・ポリクローナル抗体を作製した。本抗体をチャ葉粗抽出液に供試した結果プリメベロシダーゼを特異的に認識した。本抗体を用いてプリメベロシダーゼの葉位分布を調べた結果、若い葉ほどブリメベロシダーゼ発現量が高いことが解った。
2)二糖配糖体特異的グリコシダーゼ遺伝子のクローニング:ムシカリノキ(Viburnum furcatum)には6-O-β-D-apiofuranosyl-β-D-glucopyranosideを二糖とアグリコン(p-allylphenol)に加水分解する二糖配糖体特異的グリコシダーゼが存在することが知られている。チャ樹プリメベロシダーゼと他の植物由来β-グルコシダーゼのアミノ酸配列保存領域からプライマーを作製し、ムシカリノキの葉由来mRNAを鋳型に用いてRT-PCRを行った。その結果3種のグリコシダーゼ全長cDNAを単離し、その1つはプリメベロシダーゼに対して高い相同性(70%)を示した。このcDNAがムシカリの二糖配糖体特異的グリコシダーゼをコードしていることを、組み換え酵素を作製して酵素活性を確認する予定である。
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