2003 年度実績報告書

植物における新しい二糖配糖体特異的グリコシダーゼファミリーの解明

研究課題

研究課題/領域番号	13460049
研究機関	京都大学
研究代表者	坂田完三京都大学, 化学研究所, 教授 (20087563)
研究分担者	清水文一京都大学, 化学研究所, 助手 (50324695) 水谷正治京都大学, 化学研究所, 助手 (60303898) 平竹潤京都大学, 化学研究所, 助教授 (80199075) 加藤博章理化学研究所, 速度論的結晶学研究チーム, チームリーダー(研究職) (90204487)
キーワード	β-プリメベロシダーゼ / ジグリコシダーゼ / 二糖配糖体特異的加水分解酵素 / ファミリー1グリコシダーゼ / フルカチンヒドロラーゼ / ビシアニンヒドロラーゼ / カラスノエンドウ / アフィニティー吸着体
研究概要	本研究では、植物界に"新しい二糖配糖体特異的グリコシダーゼ(ジグリコシダーゼ)ファミリー"が存在することを明らかにし、植物におけるジグリコシダーゼの役割の解明を目指し、本年度は下記の研究を行った。 (A)ジグリコシダーゼの触媒機能および立体構造の解明 1)β-プリメベロシダーゼ(PRD)のX線結晶構造解析:チャ樹の全長PRDcDNAを昆虫細胞で発現し、培地1Lあたり約30mgのPRDが得られた。CM-Sepharose、ConA-Sepharoseカラムで精製し、単一バンドに近い精製酵素を得た。さらに、我々が開発したβ-primeverosylamidineをリガンドとしたアフィニティー吸着体が、各種ジグリコシダーゼの精製に広く利用できることが判明し、X線結晶構造解析への展望が開けた。 (B)植物における"新しいジグリコシダーゼファミリー"の確立と機能の解析 1)ムシカリのフルカチンヒドロラーゼ:そのcDNAの大腸菌での発現に成功し、本酵素もPRD同様二糖配糖体に高い基質特異性を示し、進化系統樹では予想どおり隣に位置することが明らかとなった。 2)カラスノエンドウのビシアニンヒドロラーゼ:種子に含まれる本酵素を精製し、cDNAを単離した。昆虫細胞を用いて発現させた組換え酵素は、vicianinを二糖とアグリコンに加水分解した。進化系統樹では上記2種のジグリコシダーゼの隣に位置し、サブファミリーを形成することが示唆された。 3)ジグリコシダーゼの植物体中での機能の解明: 1.二糖配糖体の二糖部分の1.6-結合の意味を探る:上記ジグリコシダーゼは何れも1.6結合を有する二糖配糖体を認識する。チャ葉PRDは6-O-benzoyl-β-D-glucopyranosideを加水分解することができるが、フルカチンヒドロラーゼはできなかった。置換基を変えて、二糖配糖体等価体の合成を試みている。 2.ジグリコシダーゼの植物界での分布:二糖配糖体の存在が報告されている植物を中心に、PRD活性、二糖生成、PRD抗体との反応を指標にしてジグリコシダーゼの存在を調べた結果、ジグリコシダーゼは植物界に広く存在することが示唆された。

研究成果

(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] Hiratake, J., Sakata, K.: "Glycosylamidines as potent selective and easily accessible glycosidase inhibitors and their application to affinity chromatography"Methods in Enzymology. 363. 421-444 (2003)
[文献書誌] Sakata, K., Mizutani, M., et al.: "Diglycoside-specific glycosidases : Recognition of carbohydrates in biological systems"Methods in Enzymology. 363. 444-459 (2003)
[文献書誌] Sakata, K., Mizutani, M., et al.: "β-Glycosylamidine as a ligand for affinity chromatography tailored to the glyconsubstrate specificity of β-glycosidase"Carbohydrate Research. 338. 1477-1490 (2003)
[文献書誌] 坂田完三: "茶の香気生成機構の研究から植物グリコシダーゼ研究の新展開へ"日本食品新素材研究会誌. 5・2. 9-17 (2003)
[文献書誌] 坂田完三, 水谷正治: "茶の香気生成とβ-プリメベロシダーゼ"Foods & Food Ingredients Journals of Japan. 208・12. 991-1033 (2003)
[文献書誌] Ahn, Y-O, Mizutani, M, Sakata, K.: "Furcatin hydrolase from Viburnum furcatum Blume is a novel disaccharide-specific acuminosidase in family 1 of the glycosyl hydrolases"Journal of Biological Chemistry. 279(in press). (2003)
[文献書誌] 渡辺修治, 坂田完三: "農芸化学の事典分担執筆:植物の香り"鈴木昭憲・荒井綜一編:朝倉書店. 650-653 (2003)

2003 年度 実績報告書

植物における新しい二糖配糖体特異的グリコシダーゼファミリーの解明

研究代表者

坂田 完三 京都大学, 化学研究所, 教授 (20087563)

研究成果

[文献書誌] Hiratake, J., Sakata, K.: "Glycosylamidines as potent selective and easily accessible glycosidase inhibitors and their application to affinity chromatography"Methods in Enzymology. 363. 421-444 (2003)

[文献書誌] Sakata, K., Mizutani, M., et al.: "Diglycoside-specific glycosidases : Recognition of carbohydrates in biological systems"Methods in Enzymology. 363. 444-459 (2003)

[文献書誌] Sakata, K., Mizutani, M., et al.: "β-Glycosylamidine as a ligand for affinity chromatography tailored to the glyconsubstrate specificity of β-glycosidase"Carbohydrate Research. 338. 1477-1490 (2003)

[文献書誌] 坂田完三: "茶の香気生成機構の研究から植物グリコシダーゼ研究の新展開へ"日本食品新素材研究会誌. 5・2. 9-17 (2003)

[文献書誌] 坂田完三, 水谷正治: "茶の香気生成とβ-プリメベロシダーゼ"Foods & Food Ingredients Journals of Japan. 208・12. 991-1033 (2003)

[文献書誌] Ahn, Y-O, Mizutani, M, Sakata, K.: "Furcatin hydrolase from Viburnum furcatum Blume is a novel disaccharide-specific acuminosidase in family 1 of the glycosyl hydrolases"Journal of Biological Chemistry. 279(in press). (2003)

[文献書誌] 渡辺修治, 坂田完三: "農芸化学の事典 分担執筆:植物の香り"鈴木昭憲・荒井綜一編:朝倉書店. 650-653 (2003)

2003 年度実績報告書

坂田完三京都大学, 化学研究所, 教授 (20087563)

[文献書誌] 渡辺修治, 坂田完三: "農芸化学の事典分担執筆:植物の香り"鈴木昭憲・荒井綜一編:朝倉書店. 650-653 (2003)