| 研究課題/領域番号 |
13460049
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物生産化学・応用有機化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
坂田 完三 京都大学, 化学研究所, 教授 (20087563)
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| 研究分担者 |
平竹 潤 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80199075)
水谷 正治 京都大学, 化学研究所, 助手 (60303898)
清水 文一 京都大学, 化学研究所, 助手 (50324695)
加藤 博章 理化学研究所, 速度論的結晶学研究チーム, チームリーダー (90204487)
SAKATA Kanzo Kyoto University, Institute for Chemical Research, Professor (20087563)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| キーワード | β-プリメベロシダーゼ / ジグリコシダーゼ / 二糖配糖体特異的加水分解酵素 / ファミリー1グリコシダーゼ / フルカチンヒドロラーゼ / ビシアニンヒドロラーゼ / グリコシルアミジン / アフィニティー吸着体 |
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| 研究概要 |
本研究では、植物界に"新しい二糖配糖体特異的グリコシダーゼ(ジグリコシダーゼ)ファミリー"が存在することを明らかにし、植物におけるこれらジグリコシダーゼの本来の機能解明を目指して研究を行い、下記の成果を得た。
(A)ジグリコシダーゼの触媒機能の解明
1)種々の基質を入手し、チャ葉β-プリメベロシダーゼ(PRD)、ムシカリのフルカチンヒドロラーゼ(FH)、カラスノエンドウのビシアニンヒドロラーゼ(VH)などのジグリコシダーゼの基質特異性を調べ、これらがβ1→6結合を有する二糖配糖体を良い基質と認識していることを確認した。
2)糖鎖修飾が可能なバキュロウイルス昆虫細胞発現系により、PRDおよびVHの全長cDNAを発現させることに成功した。FHは大腸菌での発現に成功した。PRDは培地1Lあたり約30mgの生産が可能となり、X線結晶構造解析に向けて結晶化に取り組んでいる。
3)新規グリコシルアミジン誘導体が各種糖に対して高い選択性で極めて強力な阻害活性を示すことを見いだし、これを利用してβ-primeverosyamidineをリガンドとするアフィニティー吸着体を調製した。本吸着体はPRDばかりでなく、他のジグリコシダーゼの大量精製にも応用できることが明らかとなった。
(B)植物における"新しいジグリコシダーゼファミリー"の確立
組み替えPRDを抗原として作製した抗体は高い感度と選択性を有し、若いチャ葉ほどプリメベロシダーゼ発現量が高く、細胞膜あるいは細胞間隙に局在していることが明らかとなった。また、二糖配糖体の存在が報告されている植物を中心に、PRD活性、二糖生成、PRD抗体との反応を指標にしてジグリコシダーゼの存在を調べた結果、ジグリコシダーゼは植物界に広く存在することが示唆された。さらに、全長cDNAが明らかとなった3種のジグリコシダーゼはファミリー1グルコシダーゼと高い相同性を示しPRDは予想どうり進化系統樹上FHとクラスターを形成し、VHはその隣に位置し、ジグリコシダーゼはファミリー1の中に新しいサブファミリーを形成することを明らかにした。
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