オリザシスタチンの機能構造解析およびそれに基づいた新機能性食品の創製

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13460054
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 田之倉 優 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (60136786)
• キーワード: 発光細菌 / 発光反応 / 発光関連酵素 / フラビン還元酵素 / X線結晶構造解析

研究概要

オリザシスタチンはコメ(Oryza sativa)中に含まれ、パパインなどのシステインプロテアーゼ(CP)を特異的に阻害阻害し、炊飯条件下でも活性を失わない耐熱性を持ち、酸やアルカリに対しても安定である。この蛋白質は、種子中での代謝を調節する因子であり、昆虫、細菌、ウイルスなどの外敵や感染源に存在するCPを外来性標的酵素として認識して、その活性を阻害することにより生体防御を担っているとも言われている。本研究では、第一にX線による構造解析や、蛋白質工学により部位特異的変異操作を行って、オリザシスタチンの構造と機能の相関を明らかにし、第二に、NMRによる構造解析から得られた情報をもとにオリザシスタチンのN末端近傍を類似構造をもつ甘味蛋白質モネリンのN末端へ置き換えたキメラ蛋白質の発現系を構築し、二つの蛋白質が本来もつ耐熱性と甘味活性を兼ね備えた新機能性蛋白質を創製することを目的として研究を行った。オリザシスタチンは大腸菌により発現させ、精製した。既に結晶が得られる条件はわかっていたが、精製に用いる溶液の組成を改良することでより高純度のモノマーおよびダイマーを得て、それらを用いて結晶化を行った。現在、放射光施設でこれらの結晶の回折強度データを収集する準備を進めている。一方、NMRを用いた構造解析で得られた情報に基づいて蛋白質工学の手法によりオリザシスタチンとモネリンのキメラ蛋白質の発現系を作成した。得られた発現系により大量発現を行い、蛋白質精製後、甘味活性ついての測定を行ったが、今までのところ甘味をもつキメラ蛋白質は得られていない。

研究成果

• [文献書誌] Sakai, N., Yao, M., Itou, H., Watanabe, N., Yumoto, F., Tanakura, M., Tanaka, I.: "The three-dimensional structure of septum site-determining protein MinD from Pyrococcus horikoshii OT3 in complex with Mg-ADP"Structure. 9・9. 817-826 (2001)
• [文献書誌] Yumoto, F., Nara, M., Kagi, H., Iwasaki, W., Ojima, T., Nishita, K., Nagata, K., Tanokura, M.: "Coordination structures of Ca^<+2> and Mg^<2+> in Akazara scallop troponin C in Solution : FTIR spectroscopy of side-chain COO^- Groups"European Journal of Biochemistry. 268. 6284-6290 (2001)
• [文献書誌] Tanaka, S., Ataka, M., Kubota, T., Soga, T., Homma, K., Lee, W.C., Tanokura, M.: "The effect of amphiphillic additives on the growth and morphology of Aspergillus niger acid proteinase A crystals"Journal of Crystal Growth. 234. 247-254 (2002)
• [文献書誌] Kato, Y., Ito, M., Kawai, K., Nagata, K., Tanokura, M.: "Determinants of ligand specificity in groups I and IV WW domains as studied by surface plasmon resonance and model building"Journal of Biological Chemistry. 277(in press). (2002)