| 研究概要 |
本研究の目的は,活性化される血管平滑筋細胞においてエンドセリン(ET)によりCa^<2+>透過性チャンネルのcDNAクローニングを行い,このチャンネル分子の構造と機能を解明することである。本研究では,新規チャンネルを単離するためにアフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現クローニングを行う予定であるが,そのための第一段階として,本年はチャンネル活性のスクリーニングに使用するアッセイ法の確立を試みた。まず,これまでに多用されてきた2電極ボルテージクランプ法の適用可能性を検討した。本研究では,クローン化したET受容体および血管平滑筋細胞から精製したmRNAを卵母細胞に同時に微量注入して,ET受容体刺激により活性化されるCa^<2+>電流を検出しなければならない。しかしながら,クローン化したET受容体のみを卵母細胞に発現させた場合にも,ET刺激により非常に大きな電流が観察されることから,ボルテージクランプ法はアッセイ系としては不適切であると判断した。この大きな電流はET受容体刺激自身により誘発される細胞内ストアからのCa^<2+>動員のために活性化されるCl-電流であることを確認した。このCa^<2+>動員を抑制するために,PLC阻害薬やカフェイン処理などを試みたが,いずれの処理によっても当該電流を抑制することができなかった。そこで,細胞外からのCa^<2+>流入をより特異的に検出するために,^<45>Ca^<2+>の取り込みを用いることにした。この方法を用いて,受容体を介することなくCa^<2+>流入を直接に刺激する薬物(例えば,サプシガーギン)により誘発される^<45>Ca^<2+>の取り込みを検討したところ,卵母細胞1個だけで十分にCa^<2+>流入を検出する感度を有することがわかった。このような理由により,以後の実験には^<45>Ca^<2+>の取り込みを用いることにした。血管平滑筋細胞から抽出・精製したmRNAをショ糖密度勾配超遠心法により10分画に分け,各分画をET受容体とともに卵母細胞に微量注入し48時間後に^<45>Ca^<2+>の取り込みを検討したところ,2分画にわたり高い活性が得られた。これらの分画よりcDNAライブラリーを作製し,現在更なるスクリーニングを行っている。
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