神経細胞の生存を支持する幹細胞由来神経生存因子(SDNSF)の単離と機能解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13470036
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 田代 啓 京都大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (10263097)
• 研究分担者: 高橋 淳 京都大学, 医学研究科, 助手 (10270779)
• キーワード: サイトカイン / 細胞生存支持活性 / MTTアッセイ / タンパク精製 / 神経幹細胞 / SDNSF / ポリクローナル抗体 / 細胞増殖因子

研究概要

神経幹細胞由来神経生存因子(SDNSF)は、アミノ末端に分泌シグナルシークエンスをもつ分泌タンパク質である。糖付加シグナルは見当たらず、293T細胞など哺乳類細胞に遺伝子導入してタンパク質を産生させた場合、ウエスタンブロットで、アミノ酸組成からの予測どおり19kDのバンドが検出され、翻訳後修飾は検出されなかった。SDNSFタンパクを特異的に検出するために、ウサギを免疫して、SDNSFの2カ所のエピトープに対するポリクローナル抗体を作製、抗原ペプチド親和性カラムで精製して精製抗体を得た。5×ヒスチジンタグ付きSDNSF発現プラスミドを遺伝子導入した293T細胞に5×ヒスチジンタグとの融合タンパク質を産生させ、細胞上清を出発材料にニッケルカラムで精製し、分画をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、銀染色と作製した抗SDNSF抗体を用いたウエスタンブロット法で純度をチェックしたところ80%程度の純度のSDNSF精製標品が得られていることが判明した。その精製標品を用いて、SDNSFの細胞増殖活性を3H-サイミジン又はBrdUの取り込みで、生存支持能をMTTアッセイ(細胞バイアビリティ-アッセイ)により測定し、神経幹細胞に対する生存支持活性をnanoMレベルの濃度で認めた。生存支持活性の強さは、既知の神経幹細胞増殖因子であるFGF2の60%もあることが判明した。細胞生存活性にくらべると細胞増殖活性は弱かった。

研究成果

• [文献書誌] Shinohara, M.T., Ogura, A., Ikegawa, M., Inoue, K., Ogonuki, N., Tashiro K., Toyokuni, S., Honjo, T., Shinohara., T.: "Adenovirus-mediated gene delivery and in vitro microinsemination produce offspring from infertile male mice"Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 99. 1383-1388 (2002)
• [文献書誌] Nakamura, T., Ruiz-Lozano, P., Ikeda, Y., Iwanaga, I., Hinek, A., Minamisawa, S., Chen.C.-F., Kobuke, K., Nancy.D., Takada, Y., Tashiro K., Ross, J., Honjo, T., Chien, R.K.: "Fibulin-5/DANCE is essential for elastrogenesis in vivo"Nature. 415. 171-175 (2002)
• [文献書誌] Kanazawa, N., Okazaki, T., Nishimura.H., Tashiro K., Inaba K., Miyachi, Y.: "DCIR acts as an inhibitory receptor depending on its immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif"J. Invest. Dermatol.. 118. 261-266 (2002)
• [文献書誌] Kobuke, K., Furukawa, Y., Sugai, M., Tanigaki, K., Ohashi, N, Matsumori, A., Sasayama, S., Honjo, T., Tashiro, K.: "ESDN, a novel neuropilin-like membrane protein cloned from vascular cells with the longest secretory signal sequence among eukaryotes is upregulated after vascular injury"J. Biol. Chem.. 276. 34105-34114 (2001)
• [文献書誌] Kinoshita, M., Nakamura, T., Ihara, M., Haraguchi, T., Hiraoka, Y., Tashiro, K., Noda, M.: "Identification of human endomucin-1, and -2 as membrane-bound sialoglycoproteins eith anti-adhesive activity"FEBS Lett.. 499. 121-126 (2001)
• [文献書誌] Hattori, K., Rafii, S., Heissig, B., Tashiro, K., Honjo, T., Takeno, M., Shieh, J-H.Hackett, N.R., Crystal, R.G., Moore, M.S.: "Plasma elevation of stromal derived factor-1 induces mobilization of mature and immature hemacopoietic progenitor and stem cells."Blood. 97. 3354-3360 (2001)