| 研究概要 |
本研究は、リーシュマニアのLaMDR1とLaMDR2という2つの異なるトランスポーター型ABC蛋白質による薬剤耐性のメカニズムを明らかにすることを目的として計画された。今年度は、特異抗体を用いた間接蛍光抗体法(IFA)とGreen fluorescent protein (GFP)を用いた蛍光ラベル法により,LaMDR2蛋白質の細胞内局在についての解析を行った。まず,原虫を固定したIFA法においては,抗LaMDR2抗体は原虫の細胞表面膜とは反応せず,細胞内の不特定構造,とくに体後端部に胞状に反応することが観察された。次に,GFPとLaMDR2のキメラ蛋白質を発現するベクターを作製し,それを導入した原虫株の生きた状態におけるGFPの蛍光動態について,蛍光顕微鏡ならびに共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果,GFPの蛍光は対数増殖期の生細胞で強く観察され,定常期の細胞での発現はきわめて弱かった。GFPの蛍光強度と分布は細胞によって一定しておらず,球状,袋状,棍棒状,管状などの構造として観察された。また,GFP蛍光の分布はリソソームの蛍光マーカーの分布とおおむね重なりあったが,ミトコンドリアの蛍光マーカーとの重なりは少なかった。近年,生細胞のGFP蛍光ラベル技術の進展に伴い,リーシュマニア細胞においては管状構造をとるリソソームが観察されていることから,GFPとLaMDR2のキメラ蛋白質はリソソームにターゲットされている可能性が示された。以上の結果から,リーシュマニアのLaMDR2トランスポーターによる薬剤排出はエキソサイトーシスと関連していることが強く示唆された。
|
