EBウイルスがコードする小RNA EBERの機能解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13470062
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 高田 賢蔵 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (30133721)
• 研究分担者: 岩切 大 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助手 (10307853)
• キーワード: EBウイルス / EBER / 組み換えウイルス / Cre / loxPシステム / トランスフォーメーション

研究概要

EBウイルスは(EBV)はlyticな細胞系がない。従って組換えEBVを作製するためにはEBV持続感染細胞内のEBVプラスミドへ相同組換えで外来遺伝子を導入し、そこから組換えEBVを回収するという方法を用いている。しかし相同組換えによる遺伝子改変は効率が低く、選択マーカー遺伝子が残るという問題点がある。Cre/loxP配列特異的組み換えシステムを用いると、相同組み換え後のマーカー遺伝子の除去や外来遺伝子の導入が可能となる。本研究では、このシステムを用いてバーキットリンパ種における発癌の責任遺伝子と考えられるEBERのノックアウトおよびEBVゲノム上へのEBER再導入を目的とした。
変異型loxPであるlox2272(Gene216:55,1998)はスペーサー配列に2塩基の変異を持ち、野生型loxPとの組換えが起こらない。したがって野生型loxPと変異型loxP配列にはさまれた領域を2つの分子間で置換することができるEBER遺伝子をloxP-lox2272配列にはさまれたハイグロマイシン耐性遺伝子(hyg^R)でノックアウトするためのターゲティングベクターを構築し、Akata Xneo細胞(チミジンキナーゼ遺伝子部位にG418耐性遺伝子を導入したEBVを保持する)に電気穿入法により導入した。hyg選択により得られた相同組換えのおきたEBVを含む細胞クローンにウイルス産生を誘導しEBV陰性Akata細胞に感染させることにより、EBER(-)EBVが感染した細胞を得た。この細胞にCre発現ベクターおよびloxP-lox2272配列をもつ遺伝子置換用ベクターをコトランスフェクションし、遺伝子置換によるhyg^Rの除去を行った。ウイルス産生を誘導し、EBV陰性Akata細胞に感染後、G418による薬剤選択を行った。G418耐性クローンをPCRでスクリーニングし、EBER(-)hyg^R(-)EBVが感染した細胞を得た。
RBER(-)hyg^R(-)EBVが感染したAkata細胞は76クローン中2個の効率で得られた。EBER(-)hyg^R(-)EBVを臍帯血リンパ球に感染させたところ、野生型EBVと比較してトランスフォーメーション活性が約100倍低下していた。このことからEBERがEBVのトランスフォーメーションの効率に大きな影響を与えていることがわかった。

研究成果

• [文献書誌] Nanbo, A: "Epstein-Barr virus RNA confers resistance to interferon-a-induced apoptosis in Burkett's lymphoma"EMBO J.. 21. 954-965 (2002)
• [文献書誌] Nakayama, T: "Human B cells immortalized with Epstein-Barr virus upregulate CCR6 and CCR10 and downregulate CXCR4 and CXCR5"J. Virol.. 76. 3072-3077 (2002)
• [文献書誌] Kassis J: "EBV-expressing AGS gastric carcinoma cell sublines present increased motility and invasiveness"Int. J. Cancer. 99. 644-651 (2002)
• [文献書誌] Nanbo, A: "The role of Epstein-Barr virus-encoded small RNAs (EBERs) in oncogenesis"Rev. Med. Virol.. 12・5. 321-326 (2002)
• [文献書誌] Kiss, C: "Improved subtractive suppression hybridization combined with high density cDNA array screening identifies differentially expressed viral and cellular genes"J. Virol. Methods. 107. 195-203 (2003)
• [文献書誌] Yang, L.: "Epstein-Barr virus infection of rat lymphocytes expressing human CD2 1 results in restricted latent viral gene expression but not in immunoblastic transformation"J. Med. Virol.. 70号. 126-130 (2003)