| 研究課題/領域番号 |
13470214
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
胎児・新生児医学
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
中西 敏雄 東京女子医科大学, 医学部, 助教授 (90120013)
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| 研究分担者 |
相羽 純 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (80138891)
松岡 瑠美子 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (50120051)
萩原 誠久 東京女子医科大学, 医学部, 助教授 (00180802)
羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 助手
中沢 誠 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (10075567)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| キーワード | 動脈管 / カリウムチャンネル / 酸素 / 遺伝子クローニング |
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| 研究概要 |
動脈管cDNAライブラリーの作製:豚新生仔の動脈管・大動脈・肺動脈試料からそれぞれtotal RNAを抽出、さらにpoly A^+ RNAを精製しMolony murine leukemia virus reverse transcriptase(MMLV-RT)を用いて逆転写反応しcDNAを調製した。0.5kb以上の分画をUni-XAP vector(Stratagene)に挿入し、cDNA libraryを作製した。得られた各血管libraryのtiterおよび平均のinsertの長さは、動脈管で2.56×10^6 pfu、1.7kb、大動脈で4.85×10^6 pfu、2.7kb、肺動脈で2.52×10^6、2.8kbであった。また、10kbサイズのinsertの存在も確認した。
ライブラリースクリーニング:ヒト・ラット・マウスの9種のKvαおよび5種のKvβcDNAを準備し、これらのcDNAをプローブとして用い、豚cDNAライブラリーをスクリーニングし、豚Kv1、Kv2、Kv9.3をクローニングした.
Homology-based PCR法によるKv遺伝子のスクリーニング:ヒトやラットやマウスなどのKv遺伝子を検討し、種間を通じて相同性の高い領域の塩基配列を選択した.その塩基配列にあわせてPCR用primerを合成し、肺動脈、大動脈、動脈管cDNAをテンプレートとしPCRを行った.動脈管に発現し、他の血管に発現しないか発現が少ない遺伝子を選択し、クローニングした.その結果、動脈管に発現するKV1.5,2.1,2.2に相同性をもつ遺伝子をクローニングした.
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