| 研究分担者 |
米澤 朋子 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (30304299)
大橋 俊孝 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (50194262)
二宮 善文 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (70126241)
百田 龍輔 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80263557)
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| 研究概要 |
1.リアルタイムPCR法によるADAMTS遺伝子の発現
岡山大学にて樹立されたヒト軟骨肉腫由来細胞株を培養し、アグリカナーゼ活性を上昇させる条件を検討した。同細胞株はこれまでに各種報告があり、既に安定した細胞培養系として用いられてきた実績がある。刺激後の細胞からmRNAを抽出し、RT-PCRを行い、各ADAMTSの発現を比較検討した。定量的PCRに用いるプライマーの設定が重要となるが、既にADAMTS-1,2,3,4,5,6,7,8,9,10のプライマー設計を行い、リアルタイムPCRの条件設定を行ってきた。逆転写反応にはオリゴdTプライマーではなくランダムプライマーを用いることにより、内部標準コントロールとしてリボゾーマルRNAの利用が可能になっている。既に内部標準コントロールとして、18SとGAPDHを測定し、サンプル間の差は非常に小さいものであった。既に内部標準化が終了しており、順次ADAMTSのリアルタイムPCRに取り掛かっていく状態である。
2.特異的抗体の作製
客ADAMTSに対する特異的抗体を作成する。ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作成する。特異性の評価は免疫染色・ウェスタンブロッティングだけではなく各々のADAM/ADAMTSの組換え蛋白を利用する。現在、ポリクローナル抗体をほぼ全例のADAMTSペプチドを合成し、ウサギに接種済みである。これは企業との共同研究であり、完成した抗体がリウマチ性関節炎の早期診断や早期治療薬として有効な場合には特許申請が行われる予定である。
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