毛様体筋収縮調節メカニズムへの分子生物学的アプローチ

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 13470365
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 高井 章 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (50126869)
• 研究分担者: 上村 大輔 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (00022731) ; 磯部 稔 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 教授 (00023466) ; 三宅 養三 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (30166136) ; 成瀬 恵治 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (40252233)
• キーワード: 視覚遠近調節 / 眼圧調節 / 毛様体筋 / 房水流出率 / パッチクランプ / trpイオンチャネル / 分子生物学 / 遺伝子組換え

研究概要

毛様体筋は、視覚遠近調節、眼圧調節に与る重要な眼内平滑筋組織である。この筋は、副交感神経支配下にあって、迅速に一定レベルの張力を発生し(初期相)、そのレベルを安定に保持する(保持相)という特徴を示し、これが速やかな焦点合わせと保持とを可能にしている。いずれの相においても細胞内Ca^<2+>イオンが最終的な調節因子であることは疑いないが、Ca^<2+>の動員経路には違いがあり、初期相では細胞内からの迅速な遊離が、保持相では細胞外からの流入が重要とされる。本研究では、従来ほとんど不明であった保持相におけるCa^<2+>イオン流入経路の本体の同定を目指している。第一年度の成果の概略は以下の通りである。
1.伝達物質作動性チャネルを形成する可能性が注目されている非選択性陽イオンチャネルの毛様体筋における発現を調べることとした。その目的のために、ヒトおよびマウスについて現在までに報告されている7種の哺乳類型trp遺伝子の既知配列をもとに種々のプライマペアを合成、RT-PCRにより、ウシ、モルモットおよびヒト毛様体筋において発現しているtrp遺伝子を定量的に検索した。その結果、いずれの種においても、trp1,trp3,trp4,trp6がかなり多く発現していることが確かめられたが、trp2,trp5については各々5種類以上のプライマペアも用いて検討したにもかかわらずPCRによる増幅が見られなかった。
2.PCR産物の塩基配列を決定、さらに、その大半について全cDNA配列を決定した(ウシ、モルモットのものの大半は今回新規に全配列が確定したものである)。
3.得られたcDNAを発現ベクトルに組み込んだものを単独、またはM_3型ムスカリン受容体遺伝子と同時に、培養細胞の細胞内に導入、発現してくるチャネルの性質を電気生理学的に検討することができる段階に漕着けた。
4.第二年度は、これまでに得られたtrp遺伝子のpore-forming regionに相当する部分を改変し、培養細胞に発現させ、チャネル活性への影響を調べる実験を進める予定である。
5.さらに、本チャネルに特異的に作用する天然毒素の探索を進める。

研究成果

• [文献書誌] Ito, E., Yasumoto, T., Takai, A., Imanishi, S., Harada, K.: "Investigation of the distribution and excretion of okadaic acid in mice using immunostaining method"Toxicon. 40. 159-165 (2002)
• [文献書誌] Wakimoto, T., Matsunaga, S., Takai, A., Fusetani, N.: "Insight into binding of calyculin a to protein phosphatase 1 : isolation of hemicalyculin a and chemical transformation of calyculin A"Chemistry and Biology. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] Kita, A., Matsunaga, S., Takai, A., Kataiwa, H., Wakimoto, T. et al.: "Crystal structure of the complex between calyculin A and catalytic subunit of protein phosphatase 1"Structure. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] Ito, E, Takai, A., Kondo, F., Masui, H., Imanishi, S., Harada, K.: "Comparison of protein phosphatase inhibitory activity and apparent toxicity of microcystins and related compounds"Toxicon. (印刷中). (2002)
• [文献書誌] Zhou, S. S., Takai, A, Okada, Y.: "Regulation of cardiac CFTR Cl^- channel activity by a Mg^<2+>-dependent protein phosphatase"Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. (印刷中). (2002)