| 研究課題/領域番号 |
13470429
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
朝比奈 泉 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (30221039)
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| 研究分担者 |
丸岡 豊 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (10323726)
西頭 英起 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (00332627)
春日井 昇平 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (70161049)
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| キーワード | 再生療法 / 遺伝子治療 / 骨形成たんぱく質 / 遺伝子活性化基質 / 硬組織再生 |
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| 研究概要 |
本研究は本年度よりスタートし、研究はほぼ計画通り進展しているが、一部予想に反した結果となった。
1)hBMP-2および4遺伝子のサブクローニング
われわれがすでにヒト歯髄のcDNAライブラリーからクローイングを行い、それぞれpBacBH2、pSP65プラスミドベクターに組み込まれていたhBMP-2と4のcDNAを、ネオマイシン、アンピシリン耐性サイトを持ち、たんぱく発現プラスミドベクターであるpcDNA3に組み込んだ。たま、これらプラスミドDNAに正しく遺伝子が導入されたことを確認するため、PCRで増幅した遺伝子の塩基配列を確認した結果、これらのプラスミドにhBMP-2と4が正しく組み込まれていることが確認できた。
2)in vitro トランスフェクション
1)で調整したプラスミドを293細胞と骨芽細胞様細胞MC3T3/E1にリポフェクチン法を用いトランスフェクションした。RT-PCRを用い遺伝子の発現を、培養上清によるアルカリフォスファターゼ活性を指標としてたんぱく発現を検討した。その結果、遺伝子導入効率の良い293細胞では一過性のBMPの発現を認めたが、BMPの安定した発現は認められなかった。また、MC3T3/E1には遺伝子は全く導入されなかった。
3)in vivo移植実験
hBMP-2-pcDNA3およびhBMP-4-pcDNA3をキャリアーとともにマウス皮下に移植し、2、4、8週後に摘出、骨形成の有無を検索した。ここで、DNAキャリアーとしてはコラーゲンスポンジ、グラスウール、凍結乾燥マウス胎盤を用いた。結果はいずれの標本でも骨形成を認めなかった。しかし、遺伝子導入293細胞をヌードマウス皮下に移植したところ、骨形成を認めた。
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